Abstract Freshwater ecosystems are inhabited by members of cosmopolitan bacterioplankton lineages despite the disconnected nature of these habitats. The lineages are delineated based on >97% 16S rRNA gene sequence similarity, but their intra-lineage microdiversity and phylogeography, which are key to understanding the eco-evolutional processes behind their ubiquity, remain unresolved. Here, we applied long-read amplicon sequencing targeting nearly full-length 16S rRNA genes and the adjacent ribosomal internal transcribed spacer sequences to reveal the intra-lineage diversities of pelagic bacterioplankton assemblages in 11 deep freshwater lakes in Japan and Europe. Our single nucleotide-resolved analysis, which was validated using shotgun metagenomic sequencing, uncovered 7–101 amplicon sequence variants for each of the 11 predominant bacterial lineages and demonstrated sympatric, allopatric, and temporal microdiversities that could not be resolved through conventional approaches. Clusters of samples with similar intra-lineage population compositions were identified, which consistently supported genetic isolation between Japan and Europe. At a regional scale (up to hundreds of kilometers), dispersal between lakes was unlikely to be a limiting factor, and environmental factors were potential determinants of population composition. The extent of microdiversification varied among lineages, suggesting that highly diversified lineages (e.g., Iluma-A2 and acI-A1) achieve their ubiquity by containing a consortium of genotypes specific to each habitat, while less diversified lineages (e.g., CL500-11) may be ubiquitous due to a small number of widespread genotypes. The lowest extent of intra-lineage diversification was observed among the dominant hypolimnion-specific lineage (CL500-11), suggesting that their dispersal among lakes is not limited despite the hypolimnion being a more isolated habitat than the epilimnion. Our novel approach complemented the limited resolution of short-read amplicon sequencing and limited sensitivity of the metagenome assembly-based approach, and highlighted the complex ecological processes underlying the ubiquity of freshwater bacterioplankton lineages.

Abstract Species utilizing the same resources often fail to coexist for extended periods of time. Such competitive exclusion mechanisms potentially underly microbiome dynamics, causing breakdowns of communities composed of species with similar genetic backgrounds of resource utilization. Although genes responsible for competitive exclusion among a small number of species have been investigated in pioneering studies, it remains a major challenge to integrate genomics and ecology for understanding stable coexistence in species-rich communities. Here, we show that community-scale analyses of functional gene redundancy can provide a useful platform for interpreting and predicting collapse of bacterial communities. Through 110-day time-series of experimental microbiome dynamics, we analyzed the metagenome-assembled genomes of co-occurring bacterial species. We then inferred ecological niche space based on the multivariate analysis of the genome compositions. The analysis allowed us to evaluate potential shifts in the level of niche overlap between species through time. We hypothesized that community-scale pressure of competitive exclusion could be evaluated by quantifying overlap of genetically determined resource-use profiles (metabolic pathway profiles) among coexisting species. We found that the degree of community compositional changes observed in the experimental microbiome was explained by the magnitude of gene-repertoire overlaps among bacterial species. The metagenome-based analysis of genetic potential for competitive exclusion will help us forecast major events in microbiome dynamics such as sudden community collapse (i.e., dysbiosis).

Abstract Reconstruction of metagenome-assembled genomes (MAGs) has become a fundamental approach in microbial ecology. However, an MAG is hardly complete and overlooks genomic microdiversity because metagenomic assembly fails to resolve microvariants among closely related genotypes. Aiming at understanding the universal factors that drive or constrain prokaryotic genome diversification, we performed an ecosystem-wide high-resolution metagenomic exploration of microdiversity by combining spatiotemporal (2 depths × 12 samples) sampling from a pelagic freshwater system, MAG reconstruction using long- and short-read metagenomic sequences, and profiling of single nucleotide variants (SNVs) and structural variants (SVs) through mapping of short and long reads to the MAGs, respectively. We reconstructed 575 MAGs, including 29 circular assemblies, providing high-quality reference genomes of freshwater bacterioplankton. Read mapping against these MAGs identified 100–101,781 SNVs/Mb, 0–305 insertions, 0–467 deletions, 0–41 duplications, and 0–6 inversions for each MAG. Nonsynonymous SNVs were accumulated in genes potentially involved in cell surface structural modification to evade phage recognition. Most (80.2%) deletions overlapped with a gene-coding region, and genes of prokaryotic defense systems were most frequently (>8% of the genes) involved in a deletion. Some such deletions exhibited a monthly shift in their allele frequency, suggesting a rapid turnover of genotypes in response to phage predation. MAGs with extremely low microdiversity were either rare or opportunistic bloomers, suggesting that population persistency is key to their genomic diversification. The results lead to the conclusion that prokaryotic genomic diversification is primarily driven by viral load and constrained by a population bottleneck.

Abstract The phylum Nucleocytoviricota comprises a diverse group of double-stranded DNA viruses that display a wide range of gene repertoires. Although these gene repertoires determine the characteristics of individual viruses, the evolutionary processes that have shaped the gene repertoires of extant viruses since their common ancestor are poorly characterized. In this study, we aimed to address this gap in knowledge by using amalgamated likelihood estimation (ALE), a probabilistic tree reconciliation method that infers evolutionary scenarios by distinguishing origination, gene duplications, virus-to-virus horizontal gene transfer (vHGT), and gene losses. We analyzed over 4,700 gene families from 195 genomes spanning all known viral orders. The evolutionary reconstruction suggests a history of extensive gene gains and losses during the evolution of these viruses, notably with vHGT contributing to gene gains at a comparable level to duplications and originations. The vHGT frequently occurred between phylogenetically closely related viruses, as well as between distantly related viruses with an overlapping host range. We observed a pattern of massive gene duplications that followed vHGTs for gene families that was potentially related to host range control and virus-host arms race. These results suggest that vHGT represents a previously overlooked, yet important, evolutionary force that integrates the evolutionary paths of multiple viruses and affects shaping of Nucleocytoviricota virus gene repertoires.

DNA methylation plays important roles in prokaryotes, such as in defense mechanisms against phage infection, and the corresponding genomic landscapes-prokaryotic epigenomes-have recently begun to be disclosed. However, our knowledge of prokaryote methylation systems has been severely limited to those of culturable prokaryotes, whereas environmental communities are in fact dominated by uncultured members that must harbor much more diverse DNA methyltransferases. Here, using single-molecule real-time and circular consensus sequencing techniques, we revealed the 'metaepigenomes' of an environmental prokaryotic community in the largest lake in Japan, Lake Biwa. A total of 19 draft genomes from phylogenetically diverse groups, most of which are yet to be cultured, were successfully reconstructed. The analysis of DNA chemical modifications identified 29 methylated motifs in those genomes, among which 14 motifs were novel. Furthermore, we searched for the methyltransferase genes responsible for the methylation of the detected novel motifs and confirmed their catalytic specificities via transformation experiments involving artificially synthesized genes. Finally, we found that genomes without DNA methylation tended to exhibit higher phage infection levels than those with methylation. In summary, this study proves that metaepigenomics is a powerful approach for revealing the vast unexplored variety of prokaryotic DNA methylation systems in nature.

Background: Representatives of the phylum Chloroflexi, though reportedly highly abundant (up to 30% of total prokaryotes) in the extensive deep water habitats of both marine (SAR202) and freshwater (CL500-11), remain uncultivated and uncharacterized. There are few metagenomic studies on marine Chloroflexi representatives, while the pelagic freshwater Chloroflexi community is largely unknown except for a single metagenome-assembled genome of CL500-11. Results: Here we provide the first extensive examination of the community composition of this cosmopolitan phylum in a range of pelagic habitats (176 datasets) and highlight the impact of salinity and depth on their phylogenomic composition. Reconstructed genomes (53 in total) provide a perspective on the phylogeny, metabolism and distribution of three novel classes and two family-level taxa within the phylum Chloroflexi. We unraveled a remarkable genomic diversity of pelagic freshwater Chloroflexi representatives that thrive not only in the hypolimnion as previously suspected, but also in the epilimnion. Our results suggest that the lake hypolimnion provides a globally stable habitat reflected in lower species diversity among hypolimnion specific CL500-11 and TK10 clusters in distantly related lakes compared to a higher species diversity of the epilimnion specific SL56 cluster. Cell volume analyses show that the CL500-11 are amongst the largest prokaryotic cells in the water column of deep lakes and with a biomass:abundance ratio of two they significantly contribute to the deep lake carbon flow. Metabolic insights indicate participation of JG30-KF-CM66 representatives in the global cobalamin production via cobinamide to cobalamin salvage pathway. Conclusions: Extending phylogenomic comparisons to brackish and marine habitats suggests salinity as the major influencer of the community composition of the deep-dwelling Chloroflexi in marine (SAR202) and freshwater (CL500-11) habitats as both counterparts thrive in intermediate brackish salinity however, freshwater habitats harbor the most phylogenetically diverse community of pelagic Chloroflexi representatives that reside both in epi- and hypolimnion.

Describing the variation in commonness and rarity in a community is a fundamental method of evaluating biodiversity. Such patterns have been studied in the context of species abundance distributions (SADs) among macroscopic organisms in numerous communities. Recently, models for analyzing variation in local SAD shapes along environmental gradients have been constructed. The recent development of high-throughput sequencing enables evaluation of commonness and rarity in local communities of microbes using operational taxonomic unit (OTU) read number distributions (ORDs), which are conceptually similar to SADs. However, few studies have explored the variation in local microbial ORD shapes along environmental gradients. Therefore, the similarities and differences between SADs and ORDs are unclear, clouding any universal rules of global biodiversity patterns. We investigated the similarities and differences in ORD shapes vs. SADs, and how well environmental variables explain the variation in ORDs along latitudinal and depth gradients. Herein, we integrate ORDS into recent comparative analysis methods for SAD shape using datasets generated on the Tara Oceans expedition. About 56% of the variance in skewness of ORDs among global oceanic bacterial communities was explained with this method. Moreover, we confirmed that the parameter combination constraints of Weibull distributions were shared by ORDs of bacterial communities and SADs of tree communities, suggesting common long-term limitation processes such as adaptation and community persistence acting on current abundance variation. On the other hand, skewness was significantly greater for bacterial communities than tree communities, and many ecological predictions did not apply to bacterial communities, suggesting differences in the community assembly rules for microbes and macroscopic organisms. Approaches based on ORDs provide opportunities to quantify macroecological patterns of microbes under the same framework as macroscopic organisms.

Abstract Most fungal viruses are RNA viruses and no double-stranded DNA virus that infects fungi is known to date. A recent study detected DNA polymerase genes that originated from large dsDNA viruses in the genomes of basal fungi, suggestive of the existence of dsDNA viruses capable of infecting fungi. In this study, we searched for viral infection signatures in chromosome-level genome assemblies of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis . We identified a continuous 1.5 Mb putative viral region on a chromosome in R. irregularis strain 4401. Phylogenetic analyses revealed that the viral region is related to viruses in the family Asfarviridae of the phylum Nucleocytoviricota . Single-copy marker genes from Nucleocytoviricota were detected as single-copy genes in the viral region. Furthermore, this viral region was absent in the genomes of four other R. irregularis strains and had fewer signals of fungal transposable elements than the other genomic regions. These results suggest a recent and single insertion of a large dsDNA viral genome in the genome of this fungal strain, providing strong evidence of the recent infection of the fungus by a dsDNA virus.

Summary Following the discovery of Acanthamoeba polyphaga mimivirus, diverse giant viruses have been isolated. However, only a small fraction of these isolates has been completely sequenced, limiting our understanding of the genomic diversity of giant viruses. MinION is a portable and low-cost long-read sequencer that can be readily used in a laboratory. Although MinION provides highly error-prone reads that require correction through additional short-read sequencing, recent studies assembled high-quality microbial genomes only using MinION sequencing. Here, we evaluated the accuracy of MinION-only genome assemblies for giant viruses by re-sequencing a prototype marseillevirus. Assembled genomes presented over 99.98% identity to the reference genome with a few gaps, demonstrating a high accuracy of the MinION-only assembly. As a proof of concept, we de novo assembled five newly isolated viruses. Average nucleotide identities to their closest known relatives suggest that the isolates represent new species of marseillevirus, pithovirus, and mimivirus. Assembly of subsampled reads demonstrated that their taxonomy and genomic composition could be analyzed at the 50× sequencing coverage. We also identified a pithovirus gene whose homologues were detected only in metagenome-derived relatives. Collectively, we propose that MinION-only assembly is an effective approach to rapidly perform a genome-wide analysis of isolated giant viruses.

Abstract Giant viruses are crucial for marine ecosystem dynamics because they regulate microeukaryotic community structure, accelerate carbon and nutrient cycles, and drive the evolution of their hosts through co-evolutionary processes. Previously reported long-term observations revealed that these viruses display fluctuations in abundance. However, the underlying genetic mechanisms driving such dynamics in these viruses remain largely unknown. In this study, we investigated population and intra-population dynamics of giant viruses using time-series metagenomes from eutrophic coastal seawater samples collected over 20 months. A newly developed near-automatic computational pipeline generated 1,065 high-quality metagenome-assembled genomes covering six major giant virus lineages. These genomic data revealed year-round recovery of the viral community at the study site and distinct dynamics of different viral populations classified as persistent (n = 9), seasonal (n = 389), sporadic (n = 318), or others. Notably, year-round recovery patterns were observed at the intra-population genetic diversity level for viruses classified as persistent or seasonal. Our results further indicated that the viral genome dynamics were associated with intra-population diversity; specifically, giant viruses with broader niche breadth tended to exhibit greater levels of microdiversity. We argue that greater microdiversity in viruses likely enhances adaptability and thus survival under the virus–host arms race during prolonged interactions with their hosts.