There is evidence that BDNF influences the birth of granule cells in the dentate gyrus, which is one of the few areas of the brain that demonstrates neurogenesis throughout life. However, studies to date have not examined this issue directly. To do so, we compared the effects of BDNF, phosphate-buffered saline (PBS), or bovine serum albumin (BSA) on neurogenesis after infusion into the hippocampus of the normal adult rat, using osmotic pumps that were implanted unilaterally in the dorsal hilus. BDNF, PBS, and BSA were infused for 2 weeks. The mitotic marker bromodeoxyuridine (BrdU) was administered twice daily during the 2-week infusion period. At least 1 month after infusion ended, brains were processed immunocytochemically using antibodies to BrdU, a neuronal nuclear protein (NeuN), or calbindin D28K (CaBP), which labels mature granule cells. Stereology was used to quantify BrdU-labeled cells in the dorsal hippocampus that were double-labeled with NeuN or CaBP. There was a statistically significant increase in BrdU(+)/NeuN(+) double-labeled cells in the granule cell layer after BDNF infusion relative to controls. The values for BrdU(+)/NeuN(+) cells were similar to BrdU(+)/CaBP(+) cells, indicating that most new neurons were likely to be granule cells. In addition, BrdU(+)/NeuN(+)-labeled cells developed in the hilar region after BDNF infusion, which have previously only been identified after severe continuous seizures (status epilepticus) and associated pathological changes. Remarkably, neurogenesis was also increased contralaterally, but BDNF did not appear to spread to the opposite hemisphere. Thus, infusion of BDNF to a local area can have widespread effects on hippocampal neurogenesis. The results demonstrate that BDNF administration to the dentate gyrus leads to increased neurogenesis of granule cells. They also show that ectopic granule cells develop after BDNF infusion, which suggests that ectopic migration is not necessarily confined to pathological conditions. These results are discussed in light of the evidence that BDNF increases neuronal activity in hippocampus. Thus, the mechanisms underlying neurogenesis following BDNF infusion could be due to altered activity as well as direct effects of BDNF itself, and this is relevant to studies of other growth factors because many of them have effects on neuronal excitability that are often not considered.

A group of neurons with the characteristics of dentate gyrus granule cells was found at the hilar/CA3 border several weeks after pilocarpine- or kainic acid-induced status epilepticus. Intracellular recordings from pilocarpine-treated rats showed that these "granule-like" neurons were similar to normal granule cells (i. e., those in the granule cell layer) in membrane properties, firing behavior, morphology, and their mossy fiber axon. However, in contrast to normal granule cells, they were synchronized with spontaneous, rhythmic bursts of area CA3 pyramidal cells that survived status epilepticus. Saline-treated controls lacked the population of granule-like cells at the hilar/CA3 border and CA3 bursts. In rats that were injected after status epilepticus with bromodeoxyuridine (BrdU) to label newly born cells, and also labeled for calbindin D(28K) (because it normally stains granule cells), many double-labeled neurons were located at the hilar/CA3 border. Many BrdU-labeled cells at the hilar/CA3 border also were double-labeled with a neuronal marker (NeuN). Taken together with the recent evidence that granule cells that are born after seizures can migrate into the hilus, the results suggest that some newly born granule cells migrate as far as the CA3 cell layer, where they become integrated abnormally into the CA3 network, yet they retain granule cell intrinsic properties. The results provide insight into the physiological properties of newly born granule cells in the adult brain and suggest that relatively rigid developmental programs set the membrane properties of newly born cells, but substantial plasticity is present to influence their place in pre-existing circuitry.

Acute seizures after a severe brain insult can often lead to epilepsy and cognitive impairment. Aberrant hippocampal neurogenesis follows the insult but the role of adult-generated neurons in the development of chronic seizures or associated cognitive deficits remains to be determined. Here we show that the ablation of adult neurogenesis before pilocarpine-induced acute seizures in mice leads to a reduction in chronic seizure frequency. We also show that ablation of neurogenesis normalizes epilepsy-associated cognitive deficits. Remarkably, the effect of ablating adult neurogenesis before acute seizures is long lasting as it suppresses chronic seizure frequency for nearly 1 year. These findings establish a key role of neurogenesis in chronic seizure development and associated memory impairment and suggest that targeting aberrant hippocampal neurogenesis may reduce recurrent seizures and restore cognitive function following a pro-epileptic brain insult.

Experience-dependent plasticity shapes postnatal development of neural circuits, but the mechanisms that refine dendritic arbors, remodel spines, and impair synaptic activity are poorly understood. Mature brain-derived neurotrophic factor (BDNF) modulates neuronal morphology and synaptic plasticity, including long-term potentiation (LTP) via TrkB activation. BDNF is initially translated as proBDNF, which binds p75(NTR). In vitro, recombinant proBDNF modulates neuronal structure and alters hippocampal long-term plasticity, but the actions of endogenously expressed proBDNF are unclear. Therefore, we generated a cleavage-resistant probdnf knockin mouse. Our results demonstrate that proBDNF negatively regulates hippocampal dendritic complexity and spine density through p75(NTR). Hippocampal slices from probdnf mice exhibit depressed synaptic transmission, impaired LTP, and enhanced long-term depression (LTD) in area CA1. These results suggest that proBDNF acts in vivo as a biologically active factor that regulates hippocampal structure, synaptic transmission, and plasticity, effects that are distinct from those of mature BDNF.

ABSTRACT Understanding dentate gyrus (DG) circuitry is important to clarify DG function. The effects of glutamatergic mossy cells (MCs) on the primary cell DG type, granule cells (GCs) are puzzling because MCs project directly to GCs while also innervating GABAergic neurons that inhibit GCs. Because MCs appear to primarily inhibit GCs in vivo, we hypothesized that MC→GC excitation is weak, but important nevertheless because it can facilitate other inputs and strengthen under specific conditions. Furthermore, we hypothesized that a GC subpopulation might be activated strongly by MCs, even under normal conditions. To test these hypotheses, mice with Cre-recombinase located preferentially in MCs were injected with adeno-associated virus (AAV) to express an excitatory opsin (channelrhodopsin) in MCs, or with an AAV for chemogenetics. A combination of in vitro and in vivo methods was used to assess responses of GCs to optogenetic stimulation of MCs. The results supported the idea that MC excitation is weak but in almost all GCs, and that it can increase the perforant path input to GCs, although precise timing is required. We show that MC→GC synapses strengthen after GC depolarization, trains of MC optogenetic stimuli, reduced [Mg 2+ ] o , and exposure to the cholinergic muscarinic agonist carbachol. Optogenetic stimulation of MCs in slices can lead to CA3 sharp wave-ripples (SPW-Rs) by a MC→GC→PC pathway, and chemogenetic activation of MCs during exploration in vivo can strongly activate area CA3, reflected by c-Fos protein expression. Two-photon calcium imaging in awake head-fixed mice showed that a subset of GCs are strongly activated by MCs. Together the data suggest that the MC→GC synapse is well suited for selective, conditional GC excitation, consistent with a structure that performs pattern separation. KEY POINTS In hippocampal slices, MC excitation of GCs is widespread but is usually subthreshold. MC input to GCs can increase entorhinal cortical excitation of GCs, but only within a restricted temporal window. MC activation of GCs can be strengthen by increasing MC activity, GC depolarization, NMDA receptors, or a muscarinic agonist. After MC stimulus trains or reduced [Mg 2+ ] o in vitro, MC excitation of GCs can trigger CA3 sharp wave-ripples. During exploration of novel objects, chemogenetic excitation of MCs leads to increased CA3 c-Fos immunoreactivity. During in vivo recording, calcium imaging of GCs shows that a subset of GCs are activated strongly by MCs. SIGNIFICANCE Here we show that the direct activation of dentate gyrus (DG) granule cells (GCs) by mossy cells (MCs) is widespread and, even when weak, has important effects, such as gating entorhinal input to GCs with high temporal precision. We also show that a subset of GCs is strongly activated by MCs. In addition, MC excitation of GCs can strengthen greatly under specific conditions. After strengthening, MC activation can increase neural activity in area CA3, and induce sharp wave-ripples (SPW-Rs) in CA3 pyramidal cells, which is significant because SPW-Rs are implicated in memory consolidation. Taken together with the understanding that MCs also inhibit GCs by exciting intermediary GABAergic neurons, the results suggest that MCs usually inhibit GCs, but activate GCs under select conditions. These roles are ideal for a structure that requires selective activation.

ABSTRACT Intrahippocampal kainic acid (IHKA) has been widely implemented to simulate temporal lobe epilepsy (TLE), but evidence of robust seizures is usually limited. To resolve this problem, we slightly modified previous methods and show robust seizures are common and frequent in both male and female mice. We employed continuous wideband video-EEG monitoring from 4 recording sites to best demonstrate the seizures. We found many more convulsive seizures than most studies have reported. Mortality was low. Analysis of convulsive seizures at 2-4 and 10-12 wks post-IHKA showed a robust frequency (2-4 per day on average) and duration (typically 20-30 sec) at each time. Comparison of the two timepoints showed that seizure burden became more severe in approximately 50% of the animals. We show that almost all convulsive seizures could be characterized as either low-voltage fast or hypersynchronous onset seizures, which has not been reported in a mouse model of epilepsy and is important because these seizure types are found in humans. In addition, we report that high frequency oscillations (>250 Hz) occur, resembling findings from IHKA in rats and TLE patients. Pathology in the hippocampus at the site of IHKA injection was similar to mesial temporal lobe sclerosis and reduced contralaterally. In summary, our methods produce a model of TLE in mice with robust convulsive seizures, and there is variable progression. HFOs are robust also, and seizures have onset patterns and pathology like human TLE. SIGNIFICANCE STATEMENT Although the IHKA model has been widely used in mice for epilepsy research, there is variation in outcomes, with many studies showing few robust seizures long-term, especially convulsive seizures. We present an implementation of the IHKA model with frequent convulsive seizures that are robust, meaning they are >10 sec and associated with complex high frequency rhythmic activity recorded from 2 hippocampal and 2 cortical sites. Seizure onset patterns usually matched the low-voltage fast and hypersynchronous seizures in TLE. Importantly, there is low mortality, and both sexes can be used. We believe our results will advance the ability to use the IHKA model of TLE in mice. The results also have important implications for our understanding of HFOs, progression, and other topics of broad interest to the epilepsy research community. Finally, the results have implications for preclinical drug screening because seizure frequency increased in approximately half of the mice after a 6 wk interval, suggesting that the typical 2 wk period for monitoring seizure frequency is insufficient. HIGHLIGHTS • Our implementation of the IHKA model led to robust chronic spontaneous convulsive seizures in mice • Convulsive seizures were synchronized in both hippocampi and two cortical sites • Seizure duration increased between 2-4 wks and 10-12 wks after IHKA • Convulsive seizures fit LVF and HYP types found in human temporal lobe epilepsy • HFOs (>250 Hz) were common, at >1 location, and were both ictal and interictal

ABSTRACT Glutamatergic hilar mossy cells (MCs) have axons that terminate both near and far from their cell body but stay within the DG, making synapses in the inner molecular layer primarily. The long-range axons are considered the primary projection, and extend throughout the DG ipsilateral to the soma, and project to the contralateral DG. The specificity of long-range MC axons for the inner molecular layer (IML) has been considered to be a key characteristic of the DG. In the present study we made the surprising finding that dorsal MC axons are an exception to this rule. We used two mouse lines that allow for Cre-dependent viral labeling of MCs and their axons: dopamine receptor d2 (Drd2-Cre) and calcitonin receptor-like receptor (Crlr-Cre). A single viral injection into the dorsal DG to label dorsal MCs resulted in labeling of MC axons in both the IML and middle molecular layer (MML). Interestingly, this broad termination of MC axons applied to all long-range axons. In contrast, long-range axons of ventral MCs mainly terminated in the IML, consistent with the literature. Taken together, these results suggest that dorsal and ventral MCs differ significantly in their axonal projections, and the difference is primarily in their long-range projections. Since those projections are thought to terminate primarily on GCs, the results suggest a dorsal-ventral difference in MC activation of GCs. The surprising difference in dorsal and ventral MC projections should therefore be considered when evaluating dorsal-ventral differences in DG function.

ABSTRACT Objective To test the hypothesis that high frequency oscillations (HFOs) between 250 and 500Hz occur in mouse models of Alzheimer’s disease (AD) and thus are not unique to epilepsy. Methods Experiments were conducted in three mouse models of AD: Tg2576 mice that simulate a form of familial AD, presenilin 2 knock-out (PS2KO) mice, and the Ts65Dn model of Down’s syndrome. We recorded HFOs using wideband (0.1-500Hz, 2kHz) intra-hippocampal and cortical surface EEG at 1month until 24months-old during wakefulness, slow wave sleep (SWS) and rapid eye movement (REM) sleep. Interictal spikes (IIS) and seizures were also analyzed for the possible presence of HFOs. Comparisons were made to the intra-hippocampal kainic acid and pilocarpine models of epilepsy. Results We describe for the first time that hippocampal and cortical HFOs are a new EEG abnormality in AD mouse models. HFOs occurred in all transgenic mice but no controls. They were also detectable as early as 1month of age and prior to amyloid-β plaque neuropathology. HFOs were most frequent during SWS (vs. REM or wakefulness). Notably, HFOs in the AD and epilepsy models were indistinguishable in both spectral frequency and duration. HFOs also occurred during IIS and seizures in the AD models, although with altered spectral properties compared to isolated HFOs. Significance Our data demonstrate that HFOs, an epilepsy biomarker with high translational value, are not unique to epilepsy and thus not disease specific. Our findings also strengthen the idea of hyperexcitability in AD and its significant overlap with epilepsy. HFOs in AD mouse models may serve as an EEG biomarker which is detectable from the scalp and thus amenable to non-invasive detection in people at risk for AD. KEY POINTS High frequency oscillations (HFOs, 250-500Hz) occur in mouse models of Alzheimer’s disease HFOs are detectable from the hippocampus and overlying cortex HFOs are most frequent during slow wave sleep HFOs in AD mouse models resemble HFOs in two animal models of epilepsy HFOs can be detected during interictal spikes and seizures in the AD models

ABSTRACT The dentate gyrus (DG) of the hippocampus is important for cognitive and affective behaviors. However, the circuits underlying these behaviors are unclear. DG mossy cells (MCs) have been a focus of attention because of their excitatory synapses on the primary DG cell type, granule cells (GCs). However, MCs also activate DG GABAergic neurons which inhibit GCs. We took advantage of specific methods and a gain- and loss-of function strategy with Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) to study MCs in diverse behaviors. Using this approach, manipulations of MCs could bidirectionally regulate behavior. The results suggest that inhibiting MCs can reduce anxiety-like behavior and improve cognitive performance. However, not all cognitive or anxiety-related behaviors were influenced, suggesting specific roles of MCs in some but not all types of cognition and anxiety. Notably, several behaviors showed sex-specific effects, with females often showing more pronounced effects than the males. We also used the immediate early gene c-Fos to address whether DREADDs bidirectionally regulated MC or GC activity. We confirmed excitatory DREADDs increased MC c-Fos. However, there was no change in GC c-Fos, consistent with MC activation leading to GABAergic inhibition of GCs. In contrast, inhibitory DREADDs led to a large increase in GC c-Fos, consistent with a reduction in MC excitation of GABAergic neurons, and reduced inhibition of GCs. Taken together, these results suggest that MCs regulate anxiety and cognition in specific ways. We also raise the possibility that cognitive performance may be improved by reducing anxiety. SIGNIFICANCE STATEMENT The dentate gyrus (DG) has many important cognitive roles as well as being associated with affective behavior. This study addressed how a glutamatergic DG cell type called mossy cells (MCs) contributes to diverse behaviors, which is timely because it is known that MCs regulate the activity of the primary DG cell type, granule cells (GCs), but how MC activity influences behavior is unclear. We show, surprisingly, that activating MCs can lead to adverse behavioral outcomes, and inhibiting MCs have an opposite effect. Importantly, the results appeared to be task-dependent and showed that testing both sexes was important. Additional experiments indicated what MC and GC circuitry was involved. Taken together, the results suggest how MCs influence behaviors that involve the DG.

Abstract Adeno-associated viruses (AAVs) are a commonly used tool in neuroscience to efficiently label, trace, and/or manipulate neuronal populations. Highly specific targeting can be achieved through recombinase-dependent AAVs in combination with transgenic rodent lines that express Cre-recombinase in specific cell types. Visualization of viral expression is typically achieved through fluorescent reporter proteins (e.g., GFP or mCherry) packaged within the AAV genome. Although non-amplified fluorescence is usually sufficient to observe viral expression, immunohistochemical amplification of the fluorescent reporter is routinely used to improve viral visualization. In the present study, Cre-dependent AAVs were injected into the hippocampus and cortex of wild-type C57BL/6J mice. While we observed weak but consistent non-amplified off-target DIO expression in C57BL/6J mice, antibody amplification of the GFP or mCherry reporter revealed extensive Cre-independent viral expression. Off-target expression of DIO constructs in wild-type C57BL/6J mice occurred independent of vendor, AAV serotype or promoter. We also evaluated whether Cre-independent expression had functional effects via Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs). The DREADD agonist C21 had no effect on contextual fear conditioning or cFos expression in DIO-hM3Dq-mCherry+ cells of C57BL/6J mice. Taken together, our results indicate that DIO constructs have considerable off-target expression in wild type subjects. Our findings are particularly important for the design of experiments featuring sensitive systems and/or quantitative measurements that could be negatively impacted by off-target expression. Significance Statement Adeno-associated viruses (AAV) are widely used in neuroscience because of their safety and ease of use. Combined with specific promoters, Cre/loxP, and stereotaxic injections, highly specific targeting of cells and circuits within the brain can be achieved. In the present study we injected Cre-dependent AAVs into wild-type C57BL/6J mice and found considerable Cre-independent viral expression of AAVs encoding mCherry, GFP, or hM3Dq following immunohistochemical amplification of the fluorescent reporter protein. Importantly, we observed no functional effects of the Cre-independent expression in the hippocampus, as C21 had no detectable effect on DIO-hM3Dq-mCherry infected neurons in C57BL/6J mice. Given the widespread use of DIO rAAVs by the neuroscience community, our data supports careful consideration when using DIO constructs in control animals.