To guide the design of immunotherapy strategies for patients with early stage lung tumors, we developed a multiscale immune profiling strategy to map the immune landscape of early lung adenocarcinoma lesions to search for tumor-driven immune changes. Utilizing a barcoding method that allows a simultaneous single-cell analysis of the tumor, non-involved lung, and blood cells, we provide a detailed immune cell atlas of early lung tumors. We show that stage I lung adenocarcinoma lesions already harbor significantly altered T cell and NK cell compartments. Moreover, we identified changes in tumor-infiltrating myeloid cell (TIM) subsets that likely compromise anti-tumor T cell immunity. Paired single-cell analyses thus offer valuable knowledge of tumor-driven immune changes, providing a powerful tool for the rational design of immune therapies. VIDEO ABSTRACT.

An immune fitness model for tumours under checkpoint blockade immunotherapy is proposed, through which the authors show that the presentation and recognition properties of dominant neoantigens distributed over tumour subclones are predictive of response in melanoma and lung cancer cohorts. Response to immune checkpoint blockade is likely to depend on tumour-intrinsic and microenvironmental factors, and to be evolutionarily shaped by immune interactions. Marta Łuksza et al. use mathematical tumour fitness models adapted from infectious disease models as a framework for tumour-immune interactions. When applied to human melanoma and non-small-cell lung cancer data, the model can recreate the evolutionary dynamics of cancer cells under immune checkpoint blockade. Checkpoint blockade immunotherapies enable the host immune system to recognize and destroy tumour cells1. Their clinical activity has been correlated with activated T-cell recognition of neoantigens, which are tumour-specific, mutated peptides presented on the surface of cancer cells2,3. Here we present a fitness model for tumours based on immune interactions of neoantigens that predicts response to immunotherapy. Two main factors determine neoantigen fitness: the likelihood of neoantigen presentation by the major histocompatibility complex (MHC) and subsequent recognition by T cells. We estimate these components using the relative MHC binding affinity of each neoantigen to its wild type and a nonlinear dependence on sequence similarity of neoantigens to known antigens. To describe the evolution of a heterogeneous tumour, we evaluate its fitness as a weighted effect of dominant neoantigens in the subclones of the tumour. Our model predicts survival in anti-CTLA-4-treated patients with melanoma4,5 and anti-PD-1-treated patients with lung cancer6. Importantly, low-fitness neoantigens identified by our method may be leveraged for developing novel immunotherapies. By using an immune fitness model to study immunotherapy, we reveal broad similarities between the evolution of tumours and rapidly evolving pathogens7,8,9.

ABSTRACT An emerging hallmark across human diseases – such as cancer, autoimmune and neurodegenerative disorders – is the aberrant transcription of typically silenced repetitive elements. Once active, a subset of repeats may be capable of “viral mimicry”: the display of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) that can, in principle, bind pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system and trigger inflammation. Yet how to quantify the landscape of viral mimicry and how it is shaped by natural selection remains a critical gap in our understanding of both genome evolution and the immunological basis of disease. We propose a theoretical framework to quantify selective forces on virus-like features as the entropic cost a sequence pays to hold a non-self PAMP and show our approach can predict classes of viral-mimicry within the human genome and across eukaryotes. We quantify the breadth and conservation of viral mimicry across multiple species for the first time and integrate selective forces into predictive evolutionary models. We show HSATII and intact LINE-1 (L1) are under selection to maintain CpG motifs, and specific Alu families likewise maintain the proximal presence of inverted copies to form double-stranded RNA (dsRNA). We validate our approach by predicting high CpG L1 ligands of L1 proteins and the innate receptor ZCCHC3 , and dsRNA present both intracellularly and as MDA5 ligands. We conclude viral mimicry is a general evolutionary mechanism whereby genomes co-opt pathogen-associated features generated by prone repetitive sequences, likely offering an advantage as a quality control system against transcriptional dysregulation.

Abstract Viral mimicry describes the immune response induced by endogenous stimuli such as dsRNA formed by endogenous retroelements. Activation of viral mimicry has the potential to kill cancer cells or augment anti-tumor immune response. Paradoxically, cancer cells frequently present a dysregulated epigenome, leading to increased expression of retroelements. We previously found that ADAR1 p150 upregulation is an adaptation mechanism to tolerate high retroelement-derived dsRNA levels, leading to a druggable dependency. Here, we systematically identified novel mechanisms of viral mimicry adaptation associated with cancer cell dependencies. We correlated the gene knockout sensitivity from the DepMap dataset and interferon stimulated gene (ISG) expression in the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) dataset of 1005 human cell lines and identified pathways such as RNA modification and nucleic acid metabolism. Among the top hits was the RNA decay protein XRN1 as an essential gene for the survival of a subset of cancer cell lines. XRN1-sensitive cancer cell lines have a high level of cytosolic dsRNA and high ISG expression. Furthermore, sensitivity to XRN1 knockout was mediated by MAVS and PKR activation, indicating that the cells die due to XRN1-dependent induction of viral mimicry. XRN1-resistant cell lines had low basal dsRNA levels, but became synthetically dependent on XRN1 upon treatment with viral mimicry inducing drugs such as 5-AZA-CdR or palbociclib. Finally, XRN1-dependency is partly independent of ADAR1 activity. These results confirm the potential for our ISG correlation analysis to discover novel regulators of viral mimicry and show that XRN1 activation is an adaptive mechanism to control high dsRNA stress induced by dysregulated retroelements in cancer cells and creates a dependency that can be explored for novel cancer therapies.

SUMMARY Self-renewal is a crucial property of glioblastoma cells and is enabled by the choreographed function of chromatin regulators and transcription factors. Identifying targetable epigenetic mechanisms of self-renewal could represent an important step toward developing new and effective treatments for this universally lethal cancer. Here we uncover a targetable epigenetic axis of self-renewal mediated by the histone variant macroH2A2. Using patient-derived in vitro and in vivo models, we show that macroH2A2 has a direct role in shaping chromatin accessibility at enhancer elements to antagonize transcriptional programs of self-renewal. Pharmaceutical inhibition of the chromatin remodeler Menin increased macroH2A2 levels and repressed self- renewal. Our results reveal a targetable epigenetic mechanism of self-renewal controlled by macroH2A2 and suggest new treatment approaches for glioblastoma patients. SIGNIFICANCE Glioblastoma is an incurable brain cancer. Malignant self-renewing cells have been shown to drive tumor growth, to be refractory to current treatment approaches and to seed relapses, which ultimately prove lethal. Identifying new and targetable mechanisms associated with self-renewal could be a fundamental first step in designing effective therapies that slow or prevent glioblastoma relapses. Using patient-derived models of glioblastoma, we deployed epigenomic approaches and functional assays to define the role of the histone variant macroH2A2 in repressing self-renewal. We identified compounds that increase macroH2A2 levels and repress self-renewal, including a Menin inhibitor. As Menin inhibitors are being tested in clinical trials, these compounds could be used in new therapeutic paradigms to target self-renewing cell populations in glioblastoma.

SUMMARY Gene expression profiling and proteome analysis of normal and malignant hematopoietic stem cells (HSC) point to shared core stemness properties. However, discordance between mRNA and protein signatures underscores an important role for post-transcriptional regulation by miRNAs in governing this critical nexus. Here, we identified miR-130a as a regulator of HSC self-renewal and differentiation. Enforced expression of miR-130a impaired B lymphoid differentiation and expanded long-term HSC. Integration of protein mass spectrometry and chimeric AGO2 eCLIP-seq identified TBL1XR1 as a primary miR-130a target, whose loss of function phenocopied miR-130a overexpression. Moreover, we found that miR-130a is highly expressed in t(8;21) AML where it is critical for maintaining the oncogenic molecular program mediated by AML1-ETO. Our study establishes that identification of the comprehensive miRNA targetome within primary cells enables discovery of novel genes and molecular networks underpinning stemness properties of normal and leukemic cells. HIGHLIGHTS miR-130a is a regulator of HSC self-renewal and lineage commitment TBL1XR1 is a principal target of miR-130a TBL1XR1 loss of function in HSPC phenocopies enforced expression of miR-130a Elevated miR-130a levels maintain the AML1-ETO repressive program in t(8;21) AML

Overexpression of repetitive elements is an emerging hallmark of human cancers 1 . Diverse repeats can mimic viruses by replicating within the cancer genome through retrotransposition, or presenting pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) to the pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system 2-5 . Yet, how specific repeats affect tumor evolution and shape the tumor immune microenvironment (TME) in a pro- or anti-tumorigenic manner remains poorly defined. Here, we integrate whole genome and total transcriptome data from a unique autopsy cohort of multiregional samples collected in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patients, into a comprehensive evolutionary analysis. We find that more recently evolved S hort I nterspersed N uclear E lements (SINE), a family of retrotransposable repeats, are more likely to form immunostimulatory double-strand RNAs (dsRNAs). Consequently, younger SINEs are strongly co-regulated with RIG-I like receptor associated type-I interferon genes but anti-correlated with pro-tumorigenic macrophage infiltration. We discover that immunostimulatory SINE expression in tumors is regulated by either L ong I nterspersed N uclear E lements 1 (LINE1/L1) mobility or ADAR1 activity in a TP53 mutation dependent manner. Moreover, L1 retrotransposition activity tracks with tumor evolution and is associated with TP53 mutation status. Altogether, our results suggest pancreatic tumors actively evolve to modulate immunogenic SINE stress and induce pro-tumorigenic inflammation. Our integrative, evolutionary analysis therefore illustrates, for the first time, how dark matter genomic repeats enable tumors to co-evolve with the TME by actively regulating viral mimicry to their selective advantage.

Growing evidence indicates that innate immune pathway activation is critical for responses to immunotherapy and overall cancer prognosis. It has been posited that innate immunity in the tumor microenvironment can be driven by derepression of endogenous repetitive element RNA. The ability to characterize these species can potentially provide novel predictive biomarkers for tumor immune responses and a mechanistic basis for elements of innate activation by tumors. We first compared total RNA and poly(A)-capture protocols applied to tumor RNA-sequencing to detect non-RNA coding transcriptomes in the TCGA. While the poly(A) protocol efficiently detects coding, most non-coding genes, and much of the LINE/SINE/ERV repeat repertoire, we found that it fails to capture overall repeat expression and co-expression. The probing of total RNA expression reveals distinct repetitive co-expression subgroups. Secondly, we found that total repeat element expression delivers the most dynamic changes in samples, which may serve as more robust biomarkers of clinical outcomes. Finally, we show that while expression of ERVs, but not other immunostimulatory repeats such as HSATII, is associated with response to immunotherapy in a cohort of patients with urothelial cancer treated with anti-PD-L1 therapy, global repeat derepression strongly correlates with an immunosuppressive phenotype in the microenvironment of colorectal and pancreatic tumors. We validate in situ in human primary tumors, associating the immunosuppressive phenotype with HSATII expression. In conclusion, we demonstrate the importance of analyzing repetitive element RNAs as potential biomarkers of response to immunotherapy and the need to better characterize these features in next generation sequencing protocols.