Abstract Protein kinases act as central molecular switches in the control of cellular functions. Alterations in the regulation and function of protein kinases may provoke diseases including cancer. In this study we investigate the conformational states of such disease-associated kinases using the high sensitivity of the Kinase Conformation (KinCon)-reporter system. We first tracked BRAF-kinase activity conformation changes upon melanoma drug binding. Second, we also use the KinCon reporter technology to examine the impact of regulatory protein interactions on LKB1-kinase tumor suppressor functions. Third, we explore the conformational dynamics of RIP-kinases in response to TNF-pathway activation and small molecule interactions. Finally, we show that CDK4/6 interactions with regulatory proteins alter conformations which remain unaffected in the presence of clinically applied inhibitors. Apart from its predictive value, the KinCon technology helps identify cellular factors that impact drug efficacies. The understanding of the dynamics of full-length protein kinases when interacting with small molecule inhibitors or regulatory proteins is crucial for designing more effective therapeutic strategies.

Hedgehog (Hh) ligands act as morphogens to direct patterning and proliferation during embryonic development. Protein kinase A (PKA) is a central negative regulator of Hh signalling, and in the absence of Hh ligands, PKA activity prevents inappropriate expression of Hh target genes. The G∝s-coupled receptor Gpr161 contributes to the basal Hh repression machinery by activating PKA, although the extent of this contribution is unclear. Here we show that loss of Gpr161 in zebrafish leads to constitutive activation of low-, but not high-level Hh target gene expression in the neural tube. In contrast, in the myotome, both high- and low-level Hh signalling is constitutively activated in the absence of Gpr161 function. Our results suggest that the relative contribution of Gpr161 to basal repression of Hh signalling is tissue-specific. Distinct combinations of G-protein-coupled receptors may allow the fine-tuning of PKA activity to ensure the appropriate sensitivity to Hh across different tissues.

The orphan G protein-coupled receptor (GPCR) GPR161 is enriched in primary cilia, where it plays a central role in suppressing Hedgehog signaling1. GPR161 mutations lead to developmental defects and cancers2,3,4. The fundamental basis of how GPR161 is activated, including potential endogenous activators and pathway-relevant signal transducers, remains unclear. To elucidate GPR161 function, we determined a cryogenic-electron microscopy structure of active GPR161 bound to the heterotrimeric G protein complex Gs. This structure revealed an extracellular loop 2 that occupies the canonical GPCR orthosteric ligand pocket. Furthermore, we identify a sterol that binds to a conserved extrahelical site adjacent to transmembrane helices 6 and 7 and stabilizes a GPR161 conformation required for Gs coupling. Mutations that prevent sterol binding to GPR161 suppress cAMP pathway activation. Surprisingly, these mutants retain the ability to suppress GLI2 transcription factor accumulation in cilia, a key function of ciliary GPR161 in Hedgehog pathway suppression. By contrast, a protein kinase A-binding site in the GPR161 C-terminus is critical in suppressing GLI2 ciliary accumulation. Our work highlights how unique structural features of GPR161 interface with the Hedgehog pathway and sets a foundation to understand the broader role of GPR161 function in other signaling pathways.