Abstract The ongoing global pandemic caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is responsible for the coronavirus disease 2019 (COVID-19) first described from Wuhan, China. A subset of COVID-19 patients has been reported to have acquired secondary infections by microbial pathogens, such as fungal opportunistic pathogens from the genus Aspergillus . To gain insight into COVID-19 associated pulmonary aspergillosis (CAPA), we analyzed the genomes and characterized the phenotypic profiles of four CAPA isolates of Aspergillus fumigatus obtained from patients treated in the area of North Rhine-Westphalia, Germany. By examining the mutational spectrum of single nucleotide polymorphisms, insertion-deletion polymorphisms, and copy number variants among 206 genes known to modulate A. fumigatus virulence, we found that CAPA isolate genomes do not exhibit major differences from the genome of the Af293 reference strain. By examining virulence in an invertebrate moth model, growth in the presence of osmotic, cell wall, and oxidative stressors, and the minimum inhibitory concentration of antifungal drugs, we found that CAPA isolates were generally, but not always, similar to A. fumigatus reference strains Af293 and CEA17. Notably, CAPA isolate D had more putative loss of function mutations in genes known to increase virulence when deleted (e.g., in the FLEA gene, which encodes a lectin recognized by macrophages). Moreover, CAPA isolate D was significantly more virulent than the other three CAPA isolates and the A. fumigatus reference strains tested. These findings expand our understanding of the genomic and phenotypic characteristics of isolates that cause CAPA.

Abstract Aspergillus fumigatus causes a range of human and animal diseases collectively known as aspergillosis. A. fumigatus possesses and expresses a range of genetic determinants of virulence, which facilitate colonisation and disease progression, including the secretion of mycotoxins. Gliotoxin (GT) is the best studied A. fumigatus mycotoxin with a wide range of known toxic effects that impair human immune cell function. GT is also highly toxic to A. fumigatus and this fungus has evolved self-protection mechanisms that include (i) the GT efflux pump GliA, (ii) the GT neutralising enzyme GliT, and (iii) the negative regulation of GT biosynthesis by the bis -thiomethyltransferase GtmA. The transcription factor (TF) RglT is the main regulator of GliT and this GT protection mechanism also occurs in the non-GT producing fungus A. nidulans . However, the A. nidulans genome does not encode GtmA and GliA. This work aimed at analysing the transcriptional response to exogenous GT in A. fumigatus and A. nidulans , two distantly related Aspergillus species, and to identify additional components required for GT protection. RNA-sequencing shows a highly different transcriptional response to exogenous GT with the RglT-dependent regulon also significantly differing between A. fumigatus and A. nidulans . However, we were able to observe homologs whose expression pattern was similar in both species (43 RglT-independent and 11 RglT-dependent). Based on this approach, we identified a novel RglT-dependent methyltranferase, MtrA, involved in GT protection. Taking into consideration the occurrence of RglT-independent modulated genes, we screened an A. fumigatus deletion library of 484 transcription factors (TFs) for sensitivity to GT and identified 15 TFs important for GT self-protection. Of these, the TF KojR, which is essential for kojic acid biosynthesis in Aspergillus oryzae , was also essential for virulence and GT biosynthesis in A. fumigatus , and for GT protection in A. fumigatus , A. nidulans , and A. oryzae . KojR regulates rglT , gliT , gliJ expression and sulfur metabolism in Aspergillus species. Together, this study identified conserved components required for GT protection in Aspergillus species. Author Summary A. fumigatus secretes mycotoxins that are essential for its virulence and pathogenicity. Gliotoxin (GT) is a sulfur-containing mycotoxin, which is known to impair several aspects of the human immune response. GT is also toxic to different fungal species, which have evolved several GT protection strategies. To further decipher these responses, we used transcriptional profiling aiming to compare the response to GT in the GT producer A. fumigatus and the GT non-producer A. nidulans . This analysis allowed us to identify additional genes with a potential role in GT protection. We also identified 15 transcription factors (TFs) encoded in the A. fumigatus genome that are important for conferring resistance to exogenous gliotoxin. One of these TFs, KojR, which is essential for A. oryzae kojic acid production, is also important for virulence and GT protection in A. fumigatus, A. nidulans and A. oryzae . KojR regulates the expression of another TF, an oxidoreductase, previously shown to be essential for GT protection, and sulfur metabolism. Together, this work identified conserved components required for gliotoxin protection in Aspergillus species.

Abstract Protein acetylation is a crucial post-translational modification that controls gene expression and a variety of biological processes. Sirtuins, a prominent class of NAD + -dependent lysine deacetylases, serve as key regulators of protein acetylation and gene expression in eukaryotes. In this study, six single knockout strains of fungal pathogen Aspergillus fumigatus were constructed, in addition to a strain lacking all predicted sirtuins (SIRTKO). Phenotypic assays suggest that sirtuins are involved in cell wall integrity, secondary metabolite production, thermotolerance, and virulence. AfsirE deletion resulted in attenuation of virulence, as demonstrated in murine and Galleria infection models. The absence of AfSirE leads to altered acetylation status of proteins, including histones and non-histones, resulting in significant changes in the expression of genes associated with secondary metabolism, cell wall biosynthesis, and virulence factors. These findings encourage testing sirtuin inhibitors as potential therapeutic strategies to combat A. fumigatus infections or in combination therapy with available antifungals.

Summary: ploidyNGS is a model-free, open source tool to visualize and explore ploidy levels in a newly sequenced genome, exploiting short read data. We tested ploidyNGS using both simulated and real NGS data of the model yeast Saccharomyces cerevisiae. ploidyNGS allows the identification of the ploidy level of a newly sequenced genome in a visual way. Availability and implementation: ploidyNGS is available under the GNU General Public License (GPL) at https://github.com/diriano/ploidyNGS. ploidyNGS is implemented in Python and R.

Aspergillus fischeri is a very close evolutionary relative of the major cause of invasive mold infections, Aspergillus fumigatus. In contrast to A. fumigatus, A. fischeri rarely causes invasive disease, but why such a discrepancy between the species exists is unknown. To begin to address this question, we characterized the pathogenic, genomic, and secondary metabolic similarities and differences between A. fischeri and A. fumigatus. We observed multiple differences between the two species for phenotypes related to pathogenesis, including that A. fischeri is less virulent than A. fumigatus in multiple murine models of invasive disease. In contrast, ~90% of the A. fumigatus proteome is conserved in A. fischeri, including all but one of the previously known A. fumigatus genetic determinants important for virulence. However, the two species differed substantially in their biosynthetic gene clusters (BGCs) that are likely involved in the production of secondary metabolites, with only 10 / 33 A. fumigatus BGCs also conserved in A. fischeri. Detailed chemical characterization of A. fischeri cultures grown on multiple substrates identified multiple secondary metabolites, including two new compounds and one never before isolated as a natural product. Interestingly, a deletion mutant in A. fischeri of the ortholog of a master regulator of secondary metabolism, laeA, produced fewer secondary metabolites and in lower quantities, suggesting that regulation of secondary metabolism is at least partially conserved between the two species. These results suggest that the less-pathogenic A. fischeri possesses many of the genes important for A. fumigatus pathogenicity but is divergent with respect to its secondary metabolism and its ability to thrive under infection-relevant conditions.

Fungal plant cell wall degradation processes are governed by complex regulatory mechanisms, allowing the organisms to adapt their metabolic program with high specificity to the available substrates. While the uptake of representative plant cell wall mono- and disaccharides is known to induce specific transcriptional and translational responses, the processes related to early signal reception and transduction remain largely unkown. A fast and reversible way of signal transmission are post-translational protein modifications, such as phosphorylations, which could initiate rapid adaptations of the fungal metabolism to a new condition. To elucidate how changes in the initial substrate recognition phase of Neurospora crassa affect the global phosphorylation pattern, phospho-proteomics was performed after a short (2 minutes) induction period with several plant cell wall-related mono- and disaccharides. The MS/MS-based peptide analysis revealed large-scale substrate-specific protein phosphorylation and de-phosphorylations. Using the proteins identified by MS/MS, a protein-protein-interaction (PPI) network was constructed. The variance in phosphorylation of a large number of kinases, phosphatases and transcription factors indicate the participation of many known signaling pathways, including circadian responses, two-component regulatory systems, MAP kinases as well as the cAMP-dependent and heterotrimeric G-protein pathways. Adenylate cyclase, a key component of the cAMP pathway, was identified as a potential hub for carbon source-specific differential protein interactions. In addition, four phosphorylated F-Box proteins were identified, two of which, Fbx-19 and Fbx-22, were found to be involved in carbon catabolite repression responses. Overall, these results provide unprecedented and detailed insights into a so far less well known stage of the fungal response to environmental cues and allow to better elucidate the molecular mechanisms of sensory perception and signal transduction during plant cell wall degradation.

Abstract G-protein coupled receptors (GPCRs) are extracellular signalling receptors that sense environmental cues to coordinate a biological response. Fungi sense their environment primarily through GPCR-mediated signalling pathways, which in turn regulate fungal development, metabolism, virulence and mycotoxin biosynthesis. A. fumigatus is an important human pathogen that causes aspergillosis, a heterogeneous group of diseases that presents a wide range of clinical manifestations. Here, we investigate in detail the role of the GPCRs GprM and GprJ in growth and gene expression. GprM and GprJ are important for melanin production and the regulation of the cell wall integrity (CWI) pathway. Overexpression of gprM and gprJ causes a 20 and 50% reduction in growth rate when compared to the wild-type (WT) strain, and increases sensitivity to cell wall-damaging agents. Phosphorylation of the CWI protein kinase MpkA is increased in the Δ gprM and Δ gprJ strains and decreased in the overexpression mutants when compared to the WT strain. Furthermore, differences in cell wall polysaccharide concentrations and organization were observed in these strains. RNA-sequencing suggests that GprM and GprJ negatively regulate genes encoding secondary metabolites (SMs). Mass spectrometry analysis confirmed that the production of fumagillin, pyripyropene, fumigaclavine C, fumiquinazoline, and fumitremorgin is reduced in the Δ gprM and Δ gprJ strains, and that this regulation occurs, at least partially, through the activation of MpkA. Overexpression of grpM also resulted in the regulation of many transcription factors, with AsgA predicted to function downstream of GprM and MpkA signalling. Finally, we show that the Δ gprM and Δ gprJ mutants are reduced in virulence in the Galleria mellonella insect model of invasive aspergillosis. This work further contributes to unravelling functions of A. fumigatus GPCRs and shows that GprM and GprJ are essential for CWI, secondary metabolite production and virulence. Author summary A. fumigatus is the main ethiological agent of invasive pulmonary aspergillosis, a life-threatening fungal disease that occurs in severely immuno-compromised humans. Withstanding the host environment is essential for A. fumigatus virulence and sensing of extracellular cues occurs primarily through G-protein coupled receptors (GPCRs) that activate signal transduction pathways, which in turn regulate fungal development, metabolism, virulence and mycotoxin biosynthesis. The A. fumigatus genome encodes 15 putative classical GPCRs, with only three having been functionally characterized to date. In this work, we show that the two GPCRs GprM and GprJ regulate the phosphorylation of the mitogen-activated protein kinase MpkA and thus control the regulation of the cell wall integrity pathway. GprM and GprJ are also involved in the regulation of the production of the secondary metabolites fumagillin, pyripyropene, fumigaclavine C, fumiquinazoline, melanin, and fumitremorgin and this regulation partially occurs through the activation of MpkA. Furthermore, GprM and GprJ are important for virulence in the insect model Galleria mellonella . This work therefore functionally characterizes two GPCRs and shows how they regulate several intracellular pathways that have been shown to be crucial for A. fumigatus virulence.

Cryptic fungal pathogens pose significant identification and disease management challenges due to their morphological resemblance to known pathogenic species while harboring genetic and (often) infectionrelevant trait differences. The cryptic fungal pathogen Aspergillus latus, an allodiploid hybrid originating from Aspergillus spinulosporus and an unknown close relative of Aspergillus quadrilineatus within section Nidulantes, remains poorly understood. The absence of accurate diagnostics for A. latus has led to misidentifications, hindering epidemiological studies and the design of effective treatment plans. We conducted an in-depth investigation of the genomes and phenotypes of 44 globally distributed isolates (41 clinical isolates and three type strains) from Aspergillus section Nidulantes. We found that 21 clinical isolates were A. latus; notably, standard methods of pathogen identification misidentified all A. latus isolates. The remaining isolates were identified as A. spinulosporus (8), A. quadrilineatus (1), or A. nidulans (11). Phylogenomic analyses shed light on the origin of A. latus, indicating one or two hybridization events gave rise to the species during the Miocene, approximately 15.4 to 8.8 million years ago. Characterizing the A. latus pangenome uncovered substantial genetic diversity within gene families and biosynthetic gene clusters. Transcriptomic analysis revealed that both parental genomes are actively expressed in nearly equal proportions and respond to environmental stimuli. Further investigation into infection-relevant chemical and physiological traits, including drug resistance profiles, growth under oxidative stress conditions, and secondary metabolite biosynthesis, highlight distinct phenotypic profiles of the hybrid A. latus compared to its parental and closely related species. Leveraging our comprehensive genomic and phenotypic analyses, we propose five genomic and phenotypic markers as diagnostics for A. latus species identification. These findings provide valuable insights into the evolutionary origin, genomic outcome, and phenotypic implications of hybridization in a cryptic fungal pathogen, thus enhancing our understanding of the underlying processes contributing to fungal pathogenesis. Furthermore, our study underscores the effectiveness of extensive genomic and phenotypic analyses as a promising approach for developing diagnostics applicable to future investigations of cryptic and emerging pathogens.

Abstract Aspergillosis is an important opportunistic human disease caused by filamentous fungi in the genus Aspergillus . Roughly 70% of infections are caused by Aspergillus fumigatus , with the rest stemming from approximately a dozen other Aspergillus species. Several of these pathogens are closely related to A. fumigatus and belong in the same taxonomic section, section Fumigati . Pathogenic species are frequently most closely related to non-pathogenic ones, suggesting Aspergillus pathogenicity evolved multiple times independently. To understand the repeated evolution of Aspergillus pathogenicity, we performed comparative genomic analyses on 18 strains from 13 species, including 8 species in section Fumigati , which aimed to identify genes, both ones previously connected to virulence as well as ones never before implicated, whose evolution differs between pathogens and non-pathogens. We found that most genes were present in all species, including approximately half of those previously connected to virulence, but a few genes were section- or species-specific. Evolutionary rate analyses identified hundreds of genes in pathogens that were faster-evolving than their orthologs in non-pathogens. For example, over 25% of all single-copy genes examined in A. fumigatus were faster-evolving. Functional testing of deletion mutants of 17 transcription factor-encoding genes whose evolution differed between pathogens and non-pathogens identified eight genes that affect either fungal survival in a model of phagocytic killing, host survival in an animal model of fungal disease, or both. These results suggest that the evolution of pathogenicity in Aspergillus involved both conserved and species-specific genetic elements, illustrating how an evolutionary genomic approach informs the study of fungal disease.

Filamentous fungi produce a diverse array of secondary metabolites (SMs) critical for defense, virulence, and communication. The metabolic pathways that produce SMs are found in contiguous gene clusters in fungal genomes, an atypical arrangement for metabolic pathways in other eukaryotes. Comparative studies of filamentous fungal species have shown that SM gene clusters are often either highly divergent or uniquely present in one or a handful of species, hampering efforts to determine the genetic basis and evolutionary drivers of SM gene cluster divergence. Here we examined SM variation in 66 cosmopolitan strains of a single species, the opportunistic human pathogen Aspergillus fumigatus. Investigation of genome-wide within-species variation revealed five general types of variation in SM gene clusters: non-functional gene polymorphisms, gene gain and loss polymorphisms, whole cluster gain and loss polymorphisms, allelic polymorphisms where different alleles corresponded to distinct, non-homologous clusters, and location polymorphisms in which a cluster was found to differ in its genomic location across strains. These polymorphisms affect the function of representative A. fumigatus SM gene clusters, such as those involved in the production of gliotoxin, fumigaclavine, and helvolic acid, as well as the function of clusters with undefined products. In addition to enabling the identification of polymorphisms whose detection requires extensive genome-wide synteny conservation (e.g., mobile gene clusters and non-homologous cluster alleles), our approach also implicated multiple underlying genetic drivers, including point mutations, recombination, genomic deletion and insertion events, as well as horizontal gene transfer from distant fungi. Finally, most of the variants that we uncover within A. fumigatus have been previously hypothesized to contribute to SM gene cluster diversity across entire fungal classes and phyla. We suggest that the drivers of genetic diversity operating within a fungal species shown here are sufficient to explain SM cluster macroevolutionary patterns.