Abstract Recent studies demonstrated that the Golgi stacking proteins, GRASPs, especially GRASP55, regulate Golgi-independent unconventional secretion, but the underlying mechanism remains unknown. Here, we used mutant huntingtin (Htt-Q74) as a model system to address this question. Our results demonstrate that Htt secretion is GRASP55- and autophagy-dependent, and is enhanced under stress conditions such as starvation and ER stress. Mechanistically, GRASP55 facilitates Htt secretion by tethering autophagosomes to lysosomes to promote autophagosome maturation and by stabilizing p23/TMED10, a channel for translocation of cytoplasmic proteins into the ERGIC lumen. Moreover, GRASP55 level is upregulated by various stresses to facilitate unconventional secretion, while inhibition of Htt-Q74 secretion by GRASP55 knockout enhances Htt aggregation and toxicity. Lastly, comprehensive secretomic analysis identified novel cargoes secreted by the same unconventional pathway, such as TAGLN, PAICS and PRDX1. This study provides important information on the role of GRASP55 in unconventional protein secretion and Huntington’s disease progression.

Abstract The brain expressed ubiquilins (UBQLNs) 1, 2 and 4 are a family of ubiquitin adaptor proteins that participate broadly in protein quality control (PQC) pathways, including the ubiquitin proteasome system (UPS). One family member, UBQLN2, has been implicated in numerous neurodegenerative diseases including ALS/FTD. UBQLN2 typically resides in the cytoplasm but in disease can translocate to the nucleus, as in Huntington’s disease where it promotes the clearance of mutant Huntingtin protein. How UBQLN2 translocates to the nucleus and clears aberrant nuclear proteins, however, is not well understood. In a mass spectrometry screen to discover UBQLN2 interactors, we identified a family of small (13 kDa), highly homologous uncharacterized proteins, RTL8, and confirmed the interaction between UBQLN2 and RTL8 both in vitro using recombinant proteins and in vivo using mouse brain tissue. Under endogenous and overexpressed conditions, RTL8 localizes to nucleoli. When co-expressed with UBQLN2, RTL8 promotes nuclear translocation of UBQLN2. UBQLN2 and RTL8 colocalize within ubiquitin-enriched subnuclear structures containing PQC components. The robust effect of RTL8 on the nuclear translocation and subnuclear localization of UBQLN2 does not extend to the other brain-expressed ubiquilins, UBQLN1 and UBQLN4. Moreover, compared to UBQLN1 and UBQLN4, UBQLN2 preferentially stabilizes RTL8 levels in human cell lines and in mouse brain, supporting functional heterogeneity among UBQLNs. As a novel UBQLN2 interactor that recruits UBQLN2 to specific nuclear compartments, RTL8 may regulate UBQLN2 function in nuclear protein quality control.

Antibodies that recognize specific protein conformational states are broadly important for research, diagnostic and therapeutic applications, yet they are difficult to generate in a predictable and systematic manner using either immunization or in vitro antibody display methods. This problem is particularly severe for conformational antibodies that recognize insoluble antigens such as amyloid fibrils associated with many neurodegenerative disorders. Here we report a quantitative fluorescence-activated cell sorting (FACS) method for directly selecting high-quality conformational antibodies against different types of insoluble (amyloid fibril) antigens using a single, off-the-shelf human library. Our approach uses quantum dots functionalized with antibodies to capture insoluble antigens, and the resulting quantum dot conjugates are used in a similar manner as conventional soluble antigens for multi-parameter FACS selections. Notably, we find that this approach is robust for isolating high-quality conformational antibodies against tau and α-synuclein fibrils from the same human library with combinations of high affinity, high conformational specificity and, in some cases, low off-target binding that rival or exceed those of clinical-stage antibodies specific for tau (zagotenemab) and α-synuclein (cinpanemab). This approach is expected to enable conformational antibody selection and engineering against diverse types of protein aggregates and other insoluble antigens (e.g., membrane proteins) that are compatible with presentation on the surface of antibody-functionalized quantum dots.

Abstract Transposable elements can cause catastrophic genomic instability and are tightly regulated by the host through multiple restriction pathways. Domesticated elements are derived from these ancestors and have evolved adaptive roles but may retain pathological activity. For example, PEG10 is required for placentation but also promotes cancer and neurodegeneration. While much of PEG10 remains poorly understood, a unique feature is its ability to readily form virus-like particles (VLPs) which may contribute to its adaptive and pathological nature. However, comparable restriction networks that antagonize the harmful potential of domesticated genes like PEG10 remain unknown. Here, we describe restriction of PEG10 VLP abundance via UBQLN2 and the domesticated retrotransposon RTL8 . The gag-like RTL8 antagonizes PEG10 through competitive incorporation into VLPs reminiscent of transposable element inhibitors from diverse eukaryotes. These results represent the first known instance of a retroelement-derived restriction factor antagonizing another domesticated retrotransposon and have implications for our understanding of PEG10 biology.

Abstract The brain-expressed ubiquilins, UBQLNs 1, 2 and 4, are highly homologous proteins that participate in multiple aspects of protein homeostasis and are implicated in neurodegenerative diseases. Studies have established that UBQLN2 forms liquid-like condensates and accumulates in pathogenic aggregates, much like other proteins linked to neurodegenerative diseases. However, the relative condensate and aggregate formation of the three brain-expressed ubiquilins is unknown. We report that the three ubiquilins differ in aggregation propensity, revealed by in-vitro experiments, cellular models, and analysis of human brain tissue. UBQLN4 displays heightened aggregation propensity over the other ubiquilins and, like amyloids, UBQLN4 forms ThioflavinT-positive fibrils in vitro . Measuring fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) of puncta in cells, we report that all three ubiquilins undergo liquid-liquid phase transition. UBQLN2 and 4 exhibit slower recovery than UBQLN1, suggesting the condensates formed by the brain-expressed ubiquilins have different compositions and undergo distinct internal rearrangements. We conclude that while all brain-expressed ubiquilins exhibit self-association behavior manifesting as condensates, they follow distinct courses of phase-separation and levels of aggregation. This variability among ubiquilins along the continuum from liquid-like to solid likely informs both the normal ubiquitin-linked functions of ubiquilins and their accumulation and potential contribution to toxicity in various neurodegenerative diseases.