Abstract The microtubule associated protein, tau, is implicated in a multitude of neurodegenerative disorders that are collectively termed as tauopathies. These disorders are characterized by the presence of tau aggregates within the brain of afflicted individuals. Mutations within the MAPT gene that encodes the tau protein form the genetic backdrop for familial forms of tauopathies, such as frontotemporal dementia (FTD), but the molecular consequences of such alterations and their pathological effects are unclear. We sought to investigate the conformational properties of the aggregates of three tau mutants: A152T, P301L, and R406W, all implicated within FTD, and compare them to those of the native form (WT‐Tau 2N4R). Our immunochemical analysis reveals that mutants and WT tau oligomers exhibit similar affinity for conformation‐specific antibodies but have distinct morphology and secondary structure. Additionally, these oligomers possess different dye‐binding properties and varying sensitivity to proteolytic processing. These results point to conformational variety among them. We then tested the ability of the mutant oligomers to cross‐seed the aggregation of WT tau monomer. Using similar array of experiments, we found that cross‐seeding with mutant aggregates leads to the formation of conformationally unique WT oligomers. The results discussed in this paper provide a novel perspective on the structural properties of oligomeric forms of WT tau 2N4R and its mutant, along with shedding some light on their cross‐seeding behavior.

ABSTRACT Amyloid aggregates of specific proteins form important pathological hallmarks in many neurodegenerative diseases, defining neuronal degeneration and disease onset. Recently, increasing numbers of patients show co-morbidities and overlaps between multiple neurodegenerative diseases, presenting distinct phenotypes. Such overlaps are often accompanied by co-localizations of more than one amyloid protein, prompting the question of whether direct interactions between different amyloid proteins could generate heterotypic amyloids. To answer this question, we investigated the effect of α-synuclein (αS) on TDP-43 aggregation inspired by their co-existence in pathologies such as Lewy body dementia and limbic predominant age-related TDP-43 encephalopathy. We previously showed that αS and prion-like C-terminal domain (PrLD) of TDP-43 synergistically interact with one another to generate toxic heterotypic aggregates in vitro. Here, we extend these studies to investigate whether αS induces structurally and functionally distinct polymorphs of PrLD aggregates. Using αS –PrLD heterotypic aggregates generated in two different stoichiometric proportions, we show that αS can effect PrLD fibril forms. The fibril samples have distinctive residue-level structural signatures in NMR spectra, dye-binding capability, proteinase K (PK) stability, and SDS-sensitive thermal stability. By gold nanoparticle labeling and TEM, we show the presence of both αS and PrLD proteins within the same fibrils, and thus the existence of hetertypic hybrid fibrils. We also observe that αS and PrLD co-localize in the cytosol of SH-SY5Y neuroblastoma cells, and show that the heterotypic PrLD fibrils selectively induce synaptic dysfunction in primary cortical neurons. These findings establish the existence of heterotypic amyloid polymorphs and provide a molecular basis for the observed overlap between synucleinopathies and TDP-43 proteinopathies.

Antibodies that recognize specific protein conformational states are broadly important for research, diagnostic and therapeutic applications, yet they are difficult to generate in a predictable and systematic manner using either immunization or in vitro antibody display methods. This problem is particularly severe for conformational antibodies that recognize insoluble antigens such as amyloid fibrils associated with many neurodegenerative disorders. Here we report a quantitative fluorescence-activated cell sorting (FACS) method for directly selecting high-quality conformational antibodies against different types of insoluble (amyloid fibril) antigens using a single, off-the-shelf human library. Our approach uses quantum dots functionalized with antibodies to capture insoluble antigens, and the resulting quantum dot conjugates are used in a similar manner as conventional soluble antigens for multi-parameter FACS selections. Notably, we find that this approach is robust for isolating high-quality conformational antibodies against tau and α-synuclein fibrils from the same human library with combinations of high affinity, high conformational specificity and, in some cases, low off-target binding that rival or exceed those of clinical-stage antibodies specific for tau (zagotenemab) and α-synuclein (cinpanemab). This approach is expected to enable conformational antibody selection and engineering against diverse types of protein aggregates and other insoluble antigens (e.g., membrane proteins) that are compatible with presentation on the surface of antibody-functionalized quantum dots.

Extracellular vesicles (EVs) propagate tau pathology for Alzheimer’s disease (AD). How EV transmission influences AD are, nonetheless, poorly understood. To these ends, the physicochemical and molecular structure-function relationships of human brain-derived EVs, from AD and prodromal AD (pAD), were compared to non-demented controls (CTRL). AD EVs were shown to be significantly enriched in epitope-specific tau oligomers versus pAD or CTRL EVs assayed by dot-blot and atomic force microscopy tests. AD EVs were efficiently internalized by murine cortical neurons and transferred tau with higher aggregation potency than pAD and CTRL EVs. Strikingly, inoculation of tau-containing AD EVs into the outer molecular layer of the dentate gyrus induced tau propagation throughout the hippocampus. This was seen in 22 months-old C57BL/6 mice at 4.5 months post-injection by semiquantitative brain-wide immunohistochemistry tests with multiple anti-phospho-tau (p-tau) antibodies. Inoculation of the equal amount of tau from CTRL EVs or as oligomer or fibril-enriched fraction from the same AD donor showed little propagation. AD EVs induced tau accumulation in the hippocampus as oligomers or sarkosyl-insoluble proteins. Unexpectedly, p-tau cells were mostly GAD67+ GABAergic neurons and to a lesser extent, GluR2/3+ excitatory mossy cells, showing preferential EV-mediated GABAergic neuronal tau propagation. Whole-cell patch clamp recording of Cornu Ammonis (CA1) pyramidal cells showed significant reduction in the amplitude of spontaneous inhibitory post-synaptic currents. This was accompanied by reductions in c-fos+ GAD67+GABAergic neurons and GAD67+ GABAergic neuronal puncta surrounding pyramidal neurons in the CA1 region confirming reduced interneuronal projections. Our study posits a novel tau-associated pathological mechanism for brain-derived EVs.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract Compelling evidence suggests that cognitive decline in Alzheimer’s disease is associated with accumulation and aggregation of tau protein, with the most toxic aggregates being in form of oligomers. This underscores the necessity for direct isolation and analysis of brain-derived tau oligomers from patients with Alzheimer's disease, potentially offering novel perspectives into tau toxicity. Alzheimer’s brain-derived tau oligomers are potent inhibitors of synaptic plasticity, however the involved mechanism is still not fully understood. We previously reported significantly reduced incidence of Alzheimer’s disease in aging humans chronically treated with a Food and Drug Administration-approved calcineurin inhibitor, FK506 (Tacrolimus), used as immunosuppressant after solid organ transplant. Using a combination of electrophysiological and RNA-sequencing techniques we provide here evidence that FK506 has the potential to block the acute toxic effect of brain-derived tau oligomers on synaptic plasticity, as well as to restore the levels of some key synaptic mRNAs. These results further support FK506 as a promising novel therapeutic strategy for the treatment of Alzheimer’s disease.

Tau protein blood levels dependent on its distribution to peripheral organs and possible elimination from the body. Thus, the peripheral distribution of CSF-derived tau protein was explored, especially since there is a transition to blood-based biomarkers and the emerging idea that tau pathology may spread beyond brain. Near infrared fluorescence (NIRF) was mainly used to analyze tau (tau-NIRF) distribution after its intracisternal or intravenous injection. There was a striking uptake of blood- or CSF-derived tau-NIRF protein by the skeletal structures, liver, small intestine (duodenum), gall bladder, kidneys, urinary bladder, lymph nodes, heart, and spleen. In aging and in older APP/PS1 mice, tau uptake in regions, such as the brain, liver, and skeleton, was increased. In bone (femur) injected tau protein was associated with integrin-binding sialoprotein (IBSP), a major non-collagenous glycoprotein that is associated with mineralization. Tau-NIRF was cleared slowly from CSF via mainly across the cribriform plate, and cervical lymph nodes. In brain, some of the CSF injected tau protein was associated with NeuN-positive and PDGFRý-positive cells, which may explain its retention. The presence of tau in the bladders suggested excretion routes of tau. CSF anti-tau antibody increased CSF tau clearance, while blood anti-tau antibody decreased tau accumulation in the femur but not in liver, kidney, and spleen. Thus, the data show a body-wide distribution and retention of CSF-derived tau protein, which increased with aging and in older APP/PS1 mice. Further work is needed to elucidate the relevance of tau accumulation in each organ to tauopathy.