Journal of Thrombosis and HaemostasisVolume 19, Issue 10 p. 2546-2553 BRIEF REPORTOpen Access Persistent endotheliopathy in the pathogenesis of long COVID syndrome Helen Fogarty, orcid.org/0000-0001-8161-7931 Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorLiam Townsend, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorHannah Morrin, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorAzaz Ahmad, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorClaire Comerford, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorEllie Karampini, orcid.org/0000-0003-4082-076X Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorHanna Englert, Institute of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, University Medical Center Hamburg- Eppendorf, Hamburg, GermanySearch for more papers by this authorMary Byrne, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorColm Bergin, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorJamie M. O’Sullivan, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorIgnacio Martin-Loeches, Department of Intensive Care Medicine, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorParthiban Nadarajan, Department of Respiratory Medicine, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorCiaran Bannan, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorPatrick W. Mallon, Centre for Experimental Pathogen Host Research, University College Dublin, Dublin, Ireland St Vincent's University Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorGerard F. Curley, Department of Anaesthesia and Critical Care, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorRoger J. S. Preston, orcid.org/0000-0003-0108-4077 Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland National Children’s Research Centre, Our Lady’s Children’s Hospital Crumlin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorAisling M. Rehill, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorDennis McGonagle, Leeds Institute of Rheumatic and Musculoskeletal Medicine (LIRMM), University of Leeds, Leeds, UK National Institute for Health Research (NIHR), Leeds Biomedical Research Centre (BRC), Leeds Teaching Hospitals, Leeds, UKSearch for more papers by this authorCliona Ni Cheallaigh, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorRoss I. Baker, Western Australia Centre for Thrombosis and Haemostasis, Perth Blood Institute, Murdoch University, Perth, WA, Australia Irish-Australian Blood Collaborative (IABC) Network, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorThomas Renné, Institute of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, University Medical Center Hamburg- Eppendorf, Hamburg, Germany Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), Johannes Gutenberg University Medical Center, Mainz, GermanySearch for more papers by this authorSoracha E. Ward, Corresponding Author sorachaward@rcsi.ie Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland Correspondence Soracha E. Ward, Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland, 123 St Stephen’s Green, Dublin 2, D02YN77 Dublin, Ireland. Email: sorachaward@rcsi.ie James S. O’Donnell, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, James’s St, Dublin 8, D08A978 Dublin, Ireland. Email: jamesodonnell@rcsi.ieSearch for more papers by this authorJames S. O’Donnell, Corresponding Author jamesodonnell@rcsi.ie Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland National Coagulation Centre, St James’s Hospital, Dublin, Ireland National Children’s Research Centre, Our Lady’s Children’s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland Irish-Australian Blood Collaborative (IABC) Network, Dublin, Ireland Correspondence Soracha E. Ward, Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland, 123 St Stephen’s Green, Dublin 2, D02YN77 Dublin, Ireland. Email: sorachaward@rcsi.ie James S. O’Donnell, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, James’s St, Dublin 8, D08A978 Dublin, Ireland. Email: jamesodonnell@rcsi.ieSearch for more papers by this authorthe Irish COVID-19 Vasculopathy Study (iCVS) investigators, Search for more papers by this author Helen Fogarty, orcid.org/0000-0001-8161-7931 Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorLiam Townsend, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorHannah Morrin, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorAzaz Ahmad, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorClaire Comerford, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorEllie Karampini, orcid.org/0000-0003-4082-076X Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorHanna Englert, Institute of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, University Medical Center Hamburg- Eppendorf, Hamburg, GermanySearch for more papers by this authorMary Byrne, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorColm Bergin, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorJamie M. O’Sullivan, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorIgnacio Martin-Loeches, Department of Intensive Care Medicine, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorParthiban Nadarajan, Department of Respiratory Medicine, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorCiaran Bannan, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorPatrick W. Mallon, Centre for Experimental Pathogen Host Research, University College Dublin, Dublin, Ireland St Vincent's University Hospital, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorGerard F. Curley, Department of Anaesthesia and Critical Care, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorRoger J. S. Preston, orcid.org/0000-0003-0108-4077 Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland National Children’s Research Centre, Our Lady’s Children’s Hospital Crumlin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorAisling M. Rehill, Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorDennis McGonagle, Leeds Institute of Rheumatic and Musculoskeletal Medicine (LIRMM), University of Leeds, Leeds, UK National Institute for Health Research (NIHR), Leeds Biomedical Research Centre (BRC), Leeds Teaching Hospitals, Leeds, UKSearch for more papers by this authorCliona Ni Cheallaigh, Department of Infectious Diseases, St James’s Hospital, Dublin, Ireland Department of Clinical Medicine, School of Medicine, Trinity Translational Medicine Institute, Trinity College Dublin, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorRoss I. Baker, Western Australia Centre for Thrombosis and Haemostasis, Perth Blood Institute, Murdoch University, Perth, WA, Australia Irish-Australian Blood Collaborative (IABC) Network, Dublin, IrelandSearch for more papers by this authorThomas Renné, Institute of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, University Medical Center Hamburg- Eppendorf, Hamburg, Germany Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), Johannes Gutenberg University Medical Center, Mainz, GermanySearch for more papers by this authorSoracha E. Ward, Corresponding Author sorachaward@rcsi.ie Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland Correspondence Soracha E. Ward, Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland, 123 St Stephen’s Green, Dublin 2, D02YN77 Dublin, Ireland. Email: sorachaward@rcsi.ie James S. O’Donnell, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, James’s St, Dublin 8, D08A978 Dublin, Ireland. Email: jamesodonnell@rcsi.ieSearch for more papers by this authorJames S. O’Donnell, Corresponding Author jamesodonnell@rcsi.ie Irish Centre for Vascular Biology, School of Pharmacy and Biomolecular Sciences, Royal College of Surgeons in Ireland, Dublin, Ireland National Coagulation Centre, St James’s Hospital, Dublin, Ireland National Children’s Research Centre, Our Lady’s Children’s Hospital Crumlin, Dublin, Ireland Irish-Australian Blood Collaborative (IABC) Network, Dublin, Ireland Correspondence Soracha E. Ward, Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland, 123 St Stephen’s Green, Dublin 2, D02YN77 Dublin, Ireland. Email: sorachaward@rcsi.ie James S. O’Donnell, National Coagulation Centre, St James’s Hospital, James’s St, Dublin 8, D08A978 Dublin, Ireland. Email: jamesodonnell@rcsi.ieSearch for more papers by this authorthe Irish COVID-19 Vasculopathy Study (iCVS) investigators, Search for more papers by this author First published: 10 August 2021 https://doi.org/10.1111/jth.15490Citations: 7 The members of Irish COVID-19 Vasculopathy Study (iCVS) investigators are listed in the Appendix section. Manuscript Handled by: Flora Peyvandi Final decision: Flora Peyvandi, 09 August 2021 AboutSectionsPDF ToolsRequest permissionExport citationAdd to favoritesTrack citation ShareShare Give accessShare full text accessShare full-text accessPlease review our Terms and Conditions of Use and check box below to share full-text version of article.I have read and accept the Wiley Online Library Terms and Conditions of UseShareable LinkUse the link below to share a full-text version of this article with your friends and colleagues. Learn more.Copy URL Share a linkShare onEmailFacebookTwitterLinked InRedditWechat Abstract Background Persistent symptoms including breathlessness, fatigue, and decreased exercise tolerance have been reported in patients after acute SARS-CoV-2 infection. The biological mechanisms underlying this “long COVID” syndrome remain unknown. However, autopsy studies have highlighted the key roles played by pulmonary endotheliopathy and microvascular immunothrombosis in acute COVID-19. Objectives To assess whether endothelial cell activation may be sustained in convalescent COVID-19 patients and contribute to long COVID pathogenesis. Patients and Methods Fifty patients were reviewed at a median of 68 days following SARS-CoV-2 infection. In addition to clinical workup, acute phase markers, endothelial cell (EC) activation and NETosis parameters and thrombin generation were assessed. Results Thrombin generation assays revealed significantly shorter lag times (p < .0001, 95% CI −2.57 to −1.02 min), increased endogenous thrombin potential (p = .04, 95% CI 15–416 nM/min), and peak thrombin (p < .0001, 95% CI 39–93 nM) in convalescent COVID-19 patients. These prothrombotic changes were independent of ongoing acute phase response or active NETosis. Importantly, EC biomarkers including von Willebrand factor antigen (VWF:Ag), VWF propeptide (VWFpp), and factor VIII were significantly elevated in convalescent COVID-19 compared with controls (p = .004, 95% CI 0.09–0.57 IU/ml; p = .009, 95% CI 0.06–0.5 IU/ml; p = .04, 95% CI 0.03–0.44 IU/ml, respectively). In addition, plasma soluble thrombomodulin levels were significantly elevated in convalescent COVID-19 (p = .02, 95% CI 0.01–2.7 ng/ml). Sustained endotheliopathy was more frequent in older, comorbid patients, and those requiring hospitalization. Finally, both plasma VWF:Ag and VWFpp levels correlated inversely with 6-min walk tests. Conclusions Collectively, our findings demonstrate that sustained endotheliopathy is common in convalescent COVID-19 and raise the intriguing possibility that this may contribute to long COVID pathogenesis. ESSENTIALS Ongoing endotheliopathy is a common finding in convalescent COVID-19 patients and is independent of the acute phase response. Plasma FVIII:C levels and thrombin generation are significantly increased in convalescent COVID-19 patients compared to healthy controls. Plasma VWF:Ag, VWFpp and sTM levels remain persistently elevated in a proportion of patients following apparent resolution of acute COVID-19. Markers of endotheliopathy correlate inversely with 6-min walk tests in patients with ongoing symptoms after COVID-19. 1 INTRODUCTION Recent studies have reported sustained symptoms in a significant proportion of patients following acute SARS-CoV-2 infection.1, 2 Patients with this “long COVID” syndrome complain of persistent breathlessness, fatigue, and decreased exercise tolerance.2 Although the biological mechanisms underlying these ongoing symptoms remain unknown, we recently reported that persistent increased D-dimer levels were present in approximately 25% of convalescent COVID-19 patients up to 4 months following the apparent resolution of their acute infection.3 Importantly, these increased D-dimers were seen in a significant number of both hospitalized and nonhospitalized COVID-19 patients, respectively. Similarly, von Meijenfeldt et al also observed persistently elevated D-dimers in convalescent COVID-19 patients at 4 months after hospital discharge.4 Moreover, sustained prothrombotic changes in thrombin-generating capacity were also reported. Critically, however, the biological mechanisms underlying these persistent procoagulant effects following acute COVID-19 remain poorly understood. Postmortem studies in acute COVID-19 have demonstrated disseminated thrombosis throughout the pulmonary vasculature.5-7 These thrombi are platelet- and fibrin-rich, and also contain neutrophils, neutrophil extracellular traps (NETs) and activated factor XII (FXII) that triggers the contact pathway.7, 8 Current evidence suggests pulmonary thrombi in patients with severe COVID-19 likely arise in situ within the lungs, rather than being embolic in origin.7, 9 Autopsy studies have consistently highlighted that marked pulmonary endotheliopathy is a characteristic feature of severe COVID-19.5, 7-9 Consistent with these pathological findings, plasma markers of endothelial cell (EC) activation including von Willebrand factor antigen (VWF:Ag),10-15 VWF propeptide (VWFpp),16 and soluble thrombomodulin (sTM)10 are all markedly elevated in patients with severe COVID-19. Importantly, these EC biomarkers also correlate with disease severity.10, 12, 16, 17 Given the key roles of endotheliopathy and immunothrombosis in modulating the pathogenesis of acute SARS-CoV-2,18 we hypothesized that persistent EC activation might be important in modulating ongoing procoagulant effects in convalescent COVID-19 patients and thereby contribute to the pathogenesis underpinning long COVID. 2 METHODS Consecutive adult patients were enrolled from the post-COVID-19 review clinic in St James's Hospital, Dublin, between May and September 2020. Patients were assessed at a minimum of 6 weeks following either symptom resolution in nonhospitalized patients or hospital discharge for those requiring admission.3 Informed written consent was obtained from all participants and ethical approval was obtained from the St James's Hospital Research Ethics Committee. A control group of nonhospitalized asymptomatic controls (n = 17, mean age 47 ± 12 years) were also recruited. Plasma VWF:Ag, VWFpp, FVIII:C, and sTM were analyzed as previously described.16 Thrombin generation was performed in a Fluouroskan Ascent Fluorometer with Thrombinoscope software (Stago) using PPP Low reagent (1 pM tissue factor, 4 mM phospholipids) as before.19 Additionally, the release of extracellular DNA was measured using the fluorescent DNA-intercalating dye Sytox Green (Invitrogen) and DNase activity was assessed by an in vitro NET degradation assay.20, 21 Activation of the contact factor pathway was evaluated by photometric measurement using conversion of the chromogenic substrate S-2302 (Chromogenix).22 Clinical assessment at time of outpatient review included: chest x-ray, 6-min walk test (6MWT), measuring distance covered, lowest arterial oxygen saturation, and maximal exertion (using a Modified Borg Scale). Fatigue scores were assessed using the Chalder fatigue scale.23 Statistical analyses were performed using the Mann-Whitney U tests and the Spearman rank correlation in GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, USA) with a p value of < .05 considered statistically significant. 3 RESULTS AND DISCUSSION Fifty convalescent COVID-19 patients (mean age 50 ± 17 years) were assessed at a median of 68 (interquartile range 61.3–72) days following COVID-19 symptom resolution or hospital discharge (Table S1). The majority of patients (37/50, 74%) required hospitalization during their acute COVID-19 illness and eight patients (16%) required intensive care unit admission. Median body mass index was 28 kg/m2 (interquartile range 25–32) and comorbidities were apparent in 31 patients (31/50, 62%) (Table S1). All hospitalized patients received weight- and renally adjusted low molecular weight heparin prophylaxis during their inpatient stay. Conversely, nonhospitalized and discharged patients did not receive thromboprophylaxis and none of the cohort was on anticoagulation at time of convalescent clinic review. In keeping with the recent report of von Meijenfeldt et al,4 significantly enhanced thrombin generation was observed in convalescent COVID-19 patients (Figure 1A–E and Figure S1A,B). Compared with healthy controls, lag times were significantly shorter in convalescent COVID-19 patients (medians 6.2 min vs. 8.2 min, p < .0001, 95% CI −2.57 to −1.02) (Figure 1B). Additionally, endogenous thrombin potential and peak thrombin were both significantly higher in convalescent COVID-19 patients (median endogenous thrombin potential: 1111 nM/min vs. 768 nM/min, p = .04, 95% CI 15–416; median peak thrombin: 157 nM vs. 97 nM, p < .0001, 95% CI 39–93) (Figure 1C–D). Convalescent COVID-19 patients also demonstrated a shorter time to peak compared with controls (median 9.8 min vs. 13.8 min, p < .0001, 95% CI −4.8 to −2.7) (Figure 1E). To investigate whether ongoing contact pathway activation was responsible for the effects on thrombin generation, FXII activation was assessed. No significant differences in systemic FXIIa levels were seen between a subset of convalescent patients (n = 20) and controls (n = 17) (p = .16, 95% CI −0.15 to 0.03) (Figure S1C). Elevated plasma FVIII:C levels have previously been reported in patients with acute COVID-19 and are known to influence thrombin generation. In the convalescent COVID-19 patient cohort, plasma FVIII:C levels remained significantly increased compared with controls (median 1.53 IU/ml vs. 1.13 IU/ml; p = .04, 95% CI 0.03–0.44) with 14 (28%) patients having FVIII:C levels >1.5 IU/ml (Figure 1F). Notably, one patient with FVIII:C of 2.7 IU/ml at follow-up 84 days postacute illness was later readmitted with pulmonary embolism. In addition, FVIII:C levels correlated with peak thrombin generation (p = .001) (Figure 1G). Together, these findings suggest that persistent increases in plasma FVIII levels contribute to ongoing increased thrombin generation potential in a significant proportion of convalescent COVID-19 patients. FIGURE 1Open in figure viewerPowerPoint Representative thrombin generation curves (A); each curve shows the mean of duplicate reactions from one individual's plasma. The quantitative parameters of (B) lag time, (C) endogenous thrombin potential (ETP), (D) peak thrombin, and (E) time to peak were derived from the thrombin generation curves, comparing convalescent COVID-19 (n = 50) and healthy controls (n = 17). Comparison of EC activation parameters between convalescent COVID-19 (n = 50) and healthy controls (n = 17) are shown, including (F) FVIII:C and (H) VWF:Ag. Data are presented as median and the interquartile range. Comparisons between groups were assessed by the Mann-Whitney U test. Dotted lines represent the upper and lower limits of the local normal range with results in the green shaded areas falling within the normal reference range. Correlations are shown between plasma levels of FVIII:C and (G) Peak thrombin and (I) VWF:Ag. Correlations were evaluated using the Spearman rank correlation test. (*p < .05, **p < .01, ****p < .0001). EC, endothelial cell; FVIII, factor FVIII; VWF:Ag, von Willebrand factor antigen We next investigated the mechanism(s) responsible for the sustained elevation in plasma FVIII:C levels in convalescent COVID-19 patients. Increased FVIII levels are associated with acute phase responses.24 However, in contrast to the significant elevation seen in FVIII:C levels in convalescent COVID-19 patients, acute phase markers (including C-reactive protein, neutrophil and white cell counts, interleukin-6, and sCD25 levels) had normalized in most patients (Table S1 and Figure S1D,E). Although NETosis has been implicated in acute COVID-19 immunothrombosis and endotheliopathy,8, 9 comparison of NETosis parameters in blood collected by peripheral venipuncture including DNase activity and extracellular DNA in a subset of convalescent patients and controls did not reveal any differences (median DNase activity convalescent COVID-19 (n = 20): 22 792 AU vs. controls (n = 8): 18 835 AU; p = .53 95% CI −4554 to 9410 and median extracellular DNA convalescent COVID-19 (n = 16): 0.37 μg/ml, vs. controls (n = 4): 0.37 μg/ml; p = .73, 95% CI −0.04 to 0.05) (Figure S1F–G). In normal plasma, the majority of FVIII circulates in high-affinity complex with VWF. Moreover, both FVIII and VWF are predominantly synthesized within EC.25 We observed that plasma VWF:Ag levels were also significantly increased in convalescent COVID-19 patients compared with controls (median 1.1 IU/ml vs. 0.84 IU/ml; p = .004, 95% CI 0.09–0.57) (Figure 1H). Marked interindividual variation was observed, with VWF:Ag levels ranging from 0.48 to 3.4 IU/ml in convalescence. Notably, VWF:Ag levels above the upper limit of normal were observed in 15 patients (30%) with median VWF:Ag 2.0 IU/ml in this subgroup (Figure 1H). In addition, FVIII:C levels also correlated strongly with VWF:Ag levels (r = 0.87; p < .0001) (Figure 1I). During posttranslational modification within ECs, an N-terminal 741 residue VWFpp is cleaved from each VWF monomer. VWF:Ag and VWFpp are subsequently stored together within WPB and co-secreted in equimolar amounts following EC activation. We recently reported markedly elevated VWFpp levels in acute COVID-19 and found that these levels correlated inversely with clinical outcome.16 Interestingly, VWFpp levels were also significantly elevated in convalescent COVID-19 patients compared with controls (p = .009, 95% CI 0.06–0.5) (Figure 2A). Interpatient variation was again observed, with VWFpp levels being above the upper limit of normal in 10 patients (20%). Consistent with the concept of ongoing endotheliopathy, VWFpp levels also correlated strongly with VWF:Ag levels (r = 0.87; p < .0001) (Figure 2B). Collectively, these data demonstrate that persistent endotheliopathy is a common finding in convalescent COVID-19 patients. FIGURE 2Open in figure viewerPowerPoint Comparison of EC activation parameters between convalescent COVID-19 (n = 50) and healthy controls (n = 17) including: (A) VWFpp and (C) sTM. Data are presented as median and the interquartile range. Comparisons between groups were assessed by the Mann-Whitney U test. Dotted lines represent the upper and lower limits of the local normal range with results in the green shaded areas falling within the normal reference range. Correlations are shown between plasma levels of (B) VWF:Ag vs. VWFpp and (D) VWF:Ag vs. sTM. (E) Heatmap visualization indicating EC marker levels detected in each subject (columns) for each protein (rows). (F) Convalescent VWF:Ag results are grouped according to whether acute infection was managed as an outpatient or inpatient; patients were aged ≥50 or <50 years and whether comorbidity counts were ≥2 or <2, respectively. Correlations are shown between 6-min walk test distance and plasma levels of (G) VWF:Ag and (H) VWFpp, respectively. Correlations were evaluated using the Spearman rank correlation test. (ns, not significant, *p < .05, **p < .01, ****p < .0001). EC, endothelial cell; VWF:Ag, von Willebrand factor antigen; VWFpp, von Willebrand factor propeptide Thrombomodulin (TM) is an EC surface receptor that facilitates thrombin-induced activation of protein C on EC surfaces.26 Recently, Giri et al reported that TM plays a key role in maintaining EC quiescence.27 Of particular relevance, they showed that VWF expression and secretion was markedly increased in TM-deficient ECs. Interestingly, Goshua et al also demonstrated increased shedding of TM from EC in patients with acute COVID-19. Furthermore, sTM levels were found to represent an independent prognostic biomarker.10 Given these data, we proceeded to investigate sTM levels in our cohort of convalescent COVID-19 patients. We observed that sTM levels remained significantly elevated in convalescent COVID-19 compared with controls (median 5.3 vs. 4.1 ng/ml; p = .02, 95% CI 0.01–2.7) (Figure 2C). Interestingly, the highest sTM level (14.4 ng/ml) was observed in a patient who did not require hospitalization, suggesting that sustained endotheliopathy during convalescence is not restricted to those who experienced severe COVID-19. Consistent with the concept that loss of TM may be associated with reduced EC quiescence, we observed a significant correlation between sTM levels and plasma VWF:Ag levels (Figure 2D). Highest levels of all the EC activation parameters studied were consistently observed in the convalescent COVID cohort (Figure 2E). To examine factors that influence sustained endotheliopathy following COVID-19, clinical parameters including age, comorbidities, and severity of acute illness were assessed. On univariate analysis, plasma VWF:Ag, VWFpp, FVIII:C, and sTM were all significantly higher in patients who had required hospital admission during their acute COVID-19; in patients aged ≥50 years and in patients with two or more comorbidities (Figure 2F and Figure S2A–C). These data are consistent with our previous observations that these same parameters also correlate with persistent elevated D-dimer levels in convalescent COVID-19 patients.3 Finally, we investigated the relationship between markers of sustained endotheliopathy and clinical symptoms associated with long COVID syndrome in our cohort. Interestingly, significant inverse correlations were observed on univariate analysis between 6MWT distances vs. both VWF:Ag and VWFpp, respectively (Figure 2G–H). Given this association, we sought to further evaluate using multivariable linear regression analysis including the common confounders of age, sex, and severity of initial infection. Following adjustment, however, a significant relationship between 6MWT distance and VWF:Ag (beta coefficient −4.4, 95% CI −65.5 to 56.7, p = .89) and VWFpp (beta coefficient −64.2, 95% CI −157.8 to 29.3, p = .17) was no longer seen. Our study has some limitations. These include the small number of cases, the limited period after the acute infection, and the observational and retrospective design. In addition, the relationship between clinical outcome measures such as the 6MWT may be confounded by old age and comorbidities. Finally, EC activation is not unique to COVID-19. EC activation and dysfunction have also been described to play important roles in the pathogenesis of other severe viral illnesses. including influenza.28, 29 However, specific differences in vascular perturbance between acute COVID-19 and influenza have also been described. Ackermann et al showed that at autopsy, alveolar capillary microthrombi were 9 times more prevalent in patients with COVID-19 compared with patients with influenza.5 Moreover, new pulmonary vessel formation was also significantly higher in COVID-19 patients, with prominent intussusceptive angiogenesis. In addition, Stals et al recently reported that thrombotic complications were significantly higher in hospitalized patients with acute COVID-19 compared with influenza.30 Collectively, these data suggest that are some similarities but also important differences vis-a-vis pathogenesis, endotheliopathy and immunothrombosis between acute COVID-19 and other acute viral infections. To better understand the potential translational significance of our findings, additional studies including “omics” and imaging that directly compare EC activation and dysfunction in convalescent COVID-19 patients as opposed to patients recovering from other types of severe viral illness will be essential. In conclusion, our data demonstrate for the first time that sustained EC activation is common up to 10 weeks following acute SARS-CoV-2 infection. Importantly, this persistent endotheliopathy appears to occur independently of ongoing acute phase response or NETosis and is associated with enhanced thrombin generation potential. We postulate that shedding of TM from EC may play a role in modulating the loss of normal EC quiescence. These findings are interesting given the critical role played by endotheliopathy in the pathogenesis of acute COVID-19. However, further adequately powered clinical trials will be required to determine whether this sustained EC activation and coagulation activation has a role in (1) stratifying patients at increased risk of thrombotic events after resolution of acute SARS-CoV-2 infection who may benefit from extended duration postdischarge thromboprophylaxis and/or (2) the pathogenesis of long COVID syndrome. ACKNOWLEDGMENTS The Irish COVID-19 Vasculopathy Study (ICVS) is supported by a Health Research Board COVID-19 Rapid Response award (COV19-2020-086). This research was also supported by a philanthropic grant from the 3 M Foundation to RCSI University of Medicine and Health Sciences in support of COVID-19 research. This work was performed within the Irish Clinical Academic Training (ICAT) Programme, supported by the Wellcome Trust and the Health Research Board (Grant Number 203930/B/16/Z), the Health Service Executive, National Doctors Training and Planning and the Health and Social Care, Research and Development Division, Northern Ireland. J.O.D was supported by the National Children’s Research Centre Project Award (C/18/1). T.R. acknowledges the German Research Foundation (grants A11/SFB 877, P6/KFO 306 and B8/SFB 841) for funding. Open access funding provided by IReL. CONFLICT OF INTEREST James S. O’Donnell has served on the speaker's bureau for Baxter, Bayer, Novo Nordisk, Sobi, Boehringer Ingelheim, Leo Pharma, Takeda, and Octapharma. He has also served on the advisory boards of Baxter, Sobi, Bayer, Octapharma CSL Behring, Daiichi Sankyo, Boehringer Ingelheim, Takeda, and Pfizer and has also received research grant funding awards from 3 M, Baxter, Bayer, Pfizer, Shire, Takeda, and Novo Nordisk. The remaining authors have no conflicts of interest to declare. AUTHOR CONTRIBUTION Helen Fogerty, Soracha E. Ward, Liam Townsend, Azaz Ahmad, Hannah Morrin, Claire Comerford, Cliona Ni Cheallaigh, Colm Bergin, Jamie M. O’Sullivan, and James S. O’Donnell undertook conception, patient enrollment, data collection, and interpretation. All authors contributed to literature review, final draft writing, and critical revision. All the authors have participated sufficiently in this work, take public responsibility for the content, and have made substantial contributions to this research. APPENDIX Additional investigators of the Irish COVID-19 Vasculopathy Study (ICVS). Niamh O’Connell (National Coagulation Centre, St James's Hospital, Dublin), Kevin Ryan (National Coagulation Centre, St James's Hospital, Dublin), Mary Byrne (National Coagulation Centre, St James's Hospital, Dublin), Dermot Kenny (Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland), and Judicael Fazavana (Irish Centre for Vascular Biology, Royal College of Surgeons in Ireland). Supporting Information Filename Description jth15490-sup-0001-FigS1.jpgJPEG image, 186.5 KB Fig S1 jth15490-sup-0002-FigS2.jpgJPEG image, 183.6 KB Fig S2 jth15490-sup-0003-TabS1.docxWord document, 16.2 KB Tab S1 Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article. REFERENCES 1Greenhalgh T, Knight M, A'Court C, Buxton M, Husain L. Management of post-acute covid-19 in primary care. BMJ. 2020; 370: m3026. https://doi.org/10.1136/bmj.m3026CrossrefPubMedGoogle Scholar 2Carfi A, Bernabei R, Landi F. Persistent symptoms in patients after acute COVID-19. JAMA. 2020; 324(6): 603- 605. https://doi.org/10.1001/jama.2020.12603CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 3Townsend L, Fogarty H, Dyer A, et al. Prolonged elevation of D-dimer levels in convalescent COVID-19 patients is independent of the acute phase response. J Thromb Haemost. 2021; 19(4): 1064- 1070. https://doi.org/10.1111/jth.15267Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 4von Meijenfeldt FA, Havervall S, Adelmeijer J, et al. Sustained prothrombotic changes in COVID-19 patients 4 months after hospital discharge. Blood Adv. 2021; 5: 756- 759. https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2020003968CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 5Ackermann M, Verleden SE, Kuehnel M, et al. Pulmonary vascular endothelialitis, thrombosis, and angiogenesis in Covid-19. N Engl J Med. 2020; 383: 120- 128. https://doi.org/10.1056/NEJMoa2015432CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 6Wichmann D, Sperhake J-P, Lütgehetmann M, et al. Autopsy findings and venous thromboembolism in patients with COVID-19: a prospective cohort study. Ann Intern Med. 2020; 173: 268- 277. https://doi.org/10.7326/m20-2003CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 7Rapkiewicz AV, Mai X, Carsons SE, et al. Megakaryocytes and platelet-fibrin thrombi characterize multi-organ thrombosis at autopsy in COVID-19: a case series. EClinicalMedicine. 2020; 24: 100434. https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2020.100434CrossrefPubMedGoogle Scholar 8Fox SE, Akmatbekov A, Harbert J, et al. Pulmonary and cardiac pathology in African American patients with COVID-19: an autopsy series from New Orleans. Lancet Respir Med. 2020; 8: 681- 686. https://doi.org/10.1016/S2213-2600(20)30243-5CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 9Bussani R, Schneider E, Zentilin L, et al. Persistence of viral RNA, pneumocyte syncytia and thrombosis are hallmarks of advanced COVID-19 pathology. EBioMedicine. 2020; 61: 103104. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.103104CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 10Goshua G, Pine AB, Meizlish ML, et al. Endotheliopathy in COVID-19-associated coagulopathy: evidence from a single-centre, cross-sectional study. Lancet Haematol. 2020; 7: e575- e582. https://doi.org/10.1016/s2352-3026(20)30216-7CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 11Panigada M, Bottino N, Tagliabue P, et al. Hypercoagulability of COVID-19 patients in intensive care unit: a report of thromboelastography findings and other parameters of hemostasis. J Thromb Haemost. 2020; 18: 1738- 1742. https://doi.org/10.1111/jth.14850Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 12Rauch A, Labreuche J, Lassalle F, et al. Coagulation biomarkers are independent predictors of increased oxygen requirements in COVID-19. J Thromb Haemost. 2020; 18: 2942- 2953. https://doi.org/10.1111/jth.15067Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 13Turecek PL, Peck RC, Rangarajan S, et al. Recombinant ADAMTS13 reduces abnormally up-regulated von Willebrand factor in plasma from patients with severe COVID-19. Thromb Res. 2021; 201: 100- 112. https://doi.org/10.1016/j.thromres.2021.02.012CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 14Peyvandi F, Artoni A, Novembrino C, et al. Hemostatic alterations in COVID-19. Haematologica. 2021; 106(5): 1472- 1475. CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 15Ward SE, Fogarty H, Karampini E, et al. ADAMTS13 regulation of VWF multimer distribution in severe COVID-19. J Thromb Haemost. 2021; 19(8): 1914- 1921. https://doi.org/10.1111/jth.15409Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 16Ward SE, Curley GF, Lavin M, et al. Willebrand factor propeptide in severe coronavirus disease 2019 (COVID-19): evidence of acute and sustained endothelial cell activation. Br J Haematol. 2021; 192(4): 714- 719. https://doi.org/10.1111/bjh.17273Wiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 17O'Sullivan JM, Gonagle DM, Ward SE, Preston RJS, O'Donnell JS. Endothelial cells orchestrate COVID-19 coagulopathy. Lancet Haematol. 2020; 7: e553- e555. https://doi.org/10.1016/S2352-3026(20)30215-5CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 18O'Donnell JS, Peyvandi F, Martin-Loeches I. Pulmonary immuno-thrombosis in COVID-19 ARDS pathogenesis. Intensive Care Med. 2021; 47(8): 899- 902. https://doi.org/10.1007/s00134-021-06419-wCrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 19Harmon S, Preston RJS, Ainle F, et al. Dissociation of activated protein C functions by elimination of protein S cofactor enhancement. J Biol Chem. 2008; 283: 30531- 30539. https://doi.org/10.1074/jbc.M802338200CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 20Jiménez-Alcázar M, Limacher A, Panda R, et al. Circulating extracellular DNA is an independent predictor of mortality in elderly patients with venous thromboembolism. PLoS One. 2018; 13:e0191150. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191150CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 21Jiménez-Alcázar M, Rangaswamy C, Panda R, et al. Host DNases prevent vascular occlusion by neutrophil extracellular traps. Science. 2017; 358: 1202- 1206. https://doi.org/10.1126/science.aam8897CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 22Björkqvist J, de Maat S, Lewandrowski U, et al. Defective glycosylation of coagulation factor XII underlies hereditary angioedema type III. J Clin Invest. 2015; 125: 3132- 3146. https://doi.org/10.1172/JCI77139CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 23Chalder T, Berelowitz G, Pawlikowska T, et al. Development of a fatigue scale. J Psychosom Res. 1993; 37: 147- 153. https://doi.org/10.1016/0022-3999(93)90081-pCrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 24Jenkins PV, Rawley O, Smith OP, O'Donnell JS. Elevated factor VIII levels and risk of venous thrombosis. Br J Haematol. 2012; 157: 653- 663. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2012.09134.xWiley Online LibraryCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 25Turecek PL, Johnsen JM, Pipe SW, O'Donnell JS. Biological mechanisms underlying inter-individual variation in factor VIII clearance in haemophilia. Haemophilia. 2020; 26: 575- 583. https://doi.org/10.1111/hae.14078Wiley Online LibraryPubMedWeb of Science®Google Scholar 26Gleeson EM, O'Donnell JS, Preston RJ. The endothelial cell protein C receptor: cell surface conductor of cytoprotective coagulation factor signaling. Cell Mol Life Sci. 2012; 69: 717- 726. https://doi.org/10.1007/s00018-011-0825-0CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 27Giri H, Panicker SR, Cai X, Biswas I, Weiler H, Rezaie AR. Thrombomodulin is essential for maintaining quiescence in vascular endothelial cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2021; 118(11):e2022248118. CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 28Armstrong SM, Darwish I, Lee WL. Endothelial activation and dysfunction in the pathogenesis of influenza A virus infection. Virulence. 2013; 4: 537- 542. https://doi.org/10.4161/viru.25779CrossrefPubMedWeb of Science®Google Scholar 29Teijaro JR, Walsh KB, Cahalan S, et al. Endothelial cells are central orchestrators of cytokine amplification during influenza virus infection. Cell. 2011; 146: 980- 991. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.08.015CrossrefCASPubMedWeb of Science®Google Scholar 30Stals MAM, Grootenboers MJJH, Guldener C, et al. Risk of thrombotic complications in influenza versus COVID-19 hospitalized patients. Res Pract Thromb Haemost. 2021; 5: 412- 420. https://doi.org/10.1002/rth2.12496Wiley Online LibraryCASWeb of Science®Google Scholar Citing Literature Volume19, Issue10October 2021Pages 2546-2553 This article also appears in:World Thrombosis Day Virtual Issue FiguresReferencesRelatedInformation

Introduction A clear immune correlate of protection from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection has not been defined. We explored antibody, B-cell, and T-cell responses to the third-dose vaccine and relationship to incident SARS-CoV-2 infection. Methods Adults in a prospective cohort provided blood samples at day 0, day 14, and 10 months after the third-dose SARS-CoV-2 vaccine. Participants self-reported incident SARS-CoV-2 infection. Plasma anti–SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD) and spike-subunit-1 and spike-subunit-2 antibodies were measured. A sub-study assessed SARS-CoV-2–specific plasma and memory B-cell and memory T-cell responses in peripheral blood mononuclear cells by enzyme-linked immunospot. Comparative analysis between participants who developed incident infection and uninfected participants utilised non-parametric t-tests, Kaplan–Meier survival analysis, and Cox proportional hazard ratios. Results Of the 132 participants, 47 (36%) reported incident SARS-CoV-2 infection at a median 16.5 (16.25–21) weeks after the third-dose vaccination. RBD titres and B-cell responses, but not T-cell responses, increased after the third-dose vaccine. Whereas no significant difference in day 14 antibody titres or T-cell responses was observed between participants with and without incident SARS-CoV-2 infection, RBD memory B-cell frequencies were significantly higher in those who did not develop infection [10.0% (4.5%–16.0%) versus 4.9% (1.6%–9.3%), p = 0.01]. RBD titres and memory B-cell frequencies remained significantly higher at 10 months than day 0 levels (p &lt; 0.01). Discussion Robust antibody and B-cell responses persisted at 10 months following the third-dose vaccination. Higher memory B-cell frequencies, rather than antibody titres or T-cell responses, predicted protection from subsequent infection, identifying memory B cells as a correlate of protection.

Purpose: High-quality, wide-field retinal imaging is a valuable method to screen preventable, vision-threatening diseases of the retina. Smartphone-based retinal cameras hold promise for increasing access to retinal imaging, but variable image quality and restricted field of view can limit their utility. We developed and clinically tested a smartphone-based system that addresses these challenges with automation-assisted imaging. Methods: The system was designed to improve smartphone retinal imaging by combining automated fixation guidance, photomontage, and multi-colored illumination with optimized optics, user-tested ergonomics, and touch-screen interface. System performance was evaluated from images of ophthalmic patients taken by non-ophthalmic personnel. Two masked ophthalmologists evaluated images for abnormalities and disease severity. Results: The system automatically generated 100-degree retinal photomontages from five overlapping images in under 1 minute at full resolution (52.3 pixels per retinal degree) fully on-phone, revealing numerous retinal abnormalities. Feasibility of the system for DR screening using the retinal photomontages was performed in 71 diabetics by masked graders. DR grade matched perfectly with dilated clinical examination in 55.1% of eyes and within 1 severity level for 85.2% of eyes. For referral-warranted DR, average sensitivity was 93.3% and specificity 56.8%. Conclusions: Automation-assisted imaging produced high-quality, wide-field retinal images that demonstrate the potential of smartphone-based retinal cameras to be used for retinal disease screening. Translational Relevance: Enhancement of smartphone-based retinal imaging through automation and software intelligence holds great promise for increasing the accessibility of retinal screening.

Abstract A novel proprietary formulation, ViruSAL, has previously been demonstrated to inhibit diverse enveloped viral infections in vitro and in vivo . We evaluated the ability of ViruSAL to inhibit SARS-CoV-2 infectivity, using physiologically relevant models of the human bronchial epithelium, to model early infection of the upper respiratory tract. ViruSAL potently inhibited SARS-CoV-2 infection of human bronchial epithelial cells cultured as an air-liquid interface (ALI) model, in a concentration- and time-dependent manner. Viral infection was completely inhibited when ViruSAL was added to bronchial airway models prior to infection. Importantly, ViruSAL also inhibited viral infection when added to ALI models post-infection. No evidence of in vitro cellular toxicity was detected in ViruSAL treated cells at concentrations that completely abrogated viral infectivity. Moreover, intranasal instillation of ViruSAL to a rat model did not result in any toxicity or pathological changes. Together these findings highlight the potential for ViruSAL as a novel and potent antiviral for use within clinical and prophylactic settings.

Correlates of Protection (CoP) are biomarkers above a defined threshold that can replace clinical outcomes as primary endpoints, predicting vaccine effectiveness to support the approval of new vaccines or follow up studies. In the context of COVID-19 vaccination, CoPs can help address challenges such as demonstrating vaccine effectiveness in special populations, against emerging SARS-CoV-2 variants or determining the durability of vaccine-elicited immunity. While anti-spike IgG titres and viral neutralising capacity have been characterised as CoPs for COVID-19 vaccination, the contribution of other components of the humoral immune response to immediate and long-term protective immunity is less well characterised. This review examines the evidence supporting the use of CoPs in COVID-19 clinical vaccine trials, and how they can be used to define a protective threshold of immunity. It also highlights alternative humoral immune biomarkers, including Fc effector function, mucosal immunity, and the generation of long-lived plasma and memory B cells and discuss how these can be applied to clinical studies and the tools available to study them.

Abstract Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2) infects wildlife. Recent studies highlighted that variants of concern (VOC) may expand into novel animal reservoirs with the potential for reverse zoonosis. North American white-tailed deer are the only deer species in which SARS-CoV-2 has been documented, raising the question whether further reservoir species exist as new VOC emerge. Here, we report the first cases of deer SARS-CoV-2 seropositivity in Eurasia, in a city population of fallow deer in Dublin, Ireland. Deer were seronegative in 2020 (circulating variant in humans: Alpha), one animal was seropositive in 2021 (Delta variant), and 57% of animals tested in 2022 were seropositive (Omicron variant). Ex vivo, a clinical isolate of Omicron BA.1 infected fallow deer precision cut lung slice type-2 pneumocytes, also a major target of infection in human lungs. Our findings suggest a change in host tropism as new variants emerged in the human reservoir, highlighting the importance of continued wildlife disease monitoring and limiting human-wildlife contacts. Teaser: This study is the first report of SARS-CoV-2 seropositivity in fallow deer, highlighting expansion of viral variants into new host reservoirs.

Abstract Purpose Considering the re-emergence of poliomyelitis (PM) in non-endemic regions, it becomes apparent that vaccine preventable diseases can rapidly develop epi- or even pandemic potential. Evaluation of the current vaccination status is required to inform patients, health care providers and policy makers about vaccination gaps. Methods Between October 28 2022 and November 23 2022, 5,989 adults from the VACCELEREATE Volunteer Registry completed an electronic case report form on their previous PM vaccine doses including number, types/-valencies and the time of administration based on their vaccination records. A uni-/multivariable regression analysis was performed to assess associations in participant characteristics and immunization status. Results Among German volunteers (n = 5,449), complete PM immunization schedule was found in 1,981 (36%) participants. Uncertain immunization, due to unknown previous PM vaccination ( n = 313, 6%), number of doses ( n = 497, 9%), types/-valencies ( n = 1,233, 23%) or incoherent immunization schedule ( n = 149, 3%) was found in 40% ( n = 2,192). Out of 1,276 (23%) participants who reported an incomplete immunization schedule, 62 (1%) never received any PM vaccine. A total of 5,074 (93%) volunteers reported having been vaccinated at least once and 2,087 (38%) indicated that they received vaccination within the last ten years. Female sex, younger age, as well as availability of first vaccination record were characteristics significantly associated with complete immunization ( p < 0.001). Conclusion Full PM immunization schedule was low and status frequently classified as uncertain due to lack of details on administered doses. There is an obviousneed for improved recording to enable long-term access to detailed vaccination history in the absence of a centralized immunization register.

The World Health Organization (WHO)'s Research and Development (R&D) Blueprint for Action to Prevent Epidemics, a plan of action, highlighted several infectious diseases as crucial targets for prevention. These infections were selected based on a thorough assessment of factors such as transmissibility, infectivity, severity, and evolutionary potential. In line with this blueprint, the VACCELERATE Site Network approached infectious disease experts to rank the diseases listed in the WHO R&D Blueprint according to their perceived risk of triggering a pandemic. VACCELERATE is an EU-funded collaborative European network of clinical trial sites, established to respond to emerging pandemics and enhance vaccine development capabilities.Between February and June 2023, a survey was conducted using an online form to collect data from members of the VACCELERATE Site Network and infectious disease experts worldwide. Participants were asked to rank various pathogens based on their perceived risk of causing a pandemic, including those listed in the WHO R&D Blueprint and additional pathogens.A total of 187 responses were obtained from infectious disease experts representing 57 countries, with Germany, Spain, and Italy providing the highest number of replies. Influenza viruses received the highest rankings among the pathogens, with 79 % of participants including them in their top rankings. Disease X, SARS-CoV-2, SARS-CoV, and Ebola virus were also ranked highly. Hantavirus, Lassa virus, Nipah virus, and henipavirus were among the bottom-ranked pathogens in terms of pandemic potential.Influenza, SARS-CoV, SARS-CoV-2, and Ebola virus were found to be the most concerning pathogens with pandemic potential, characterised by transmissibility through respiratory droplets and a reported history of epidemic or pandemic outbreaks.