ADVERTISEMENT RETURN TO ISSUEPREVArticleNEXTModel studies for the synthesis of quassinoids. 1. Construction of the BCE ring systemGeorge A. Kraus and Michael J. TaschnerCite this: J. Org. Chem. 1980, 45, 6, 1175–1176Publication Date (Print):March 1, 1980Publication History Published online1 May 2002Published inissue 1 March 1980https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jo01294a058https://doi.org/10.1021/jo01294a058research-articleACS PublicationsRequest reuse permissionsArticle Views3594Altmetric-Citations308LEARN ABOUT THESE METRICSArticle Views are the COUNTER-compliant sum of full text article downloads since November 2008 (both PDF and HTML) across all institutions and individuals. These metrics are regularly updated to reflect usage leading up to the last few days.Citations are the number of other articles citing this article, calculated by Crossref and updated daily. Find more information about Crossref citation counts.The Altmetric Attention Score is a quantitative measure of the attention that a research article has received online. Clicking on the donut icon will load a page at altmetric.com with additional details about the score and the social media presence for the given article. Find more information on the Altmetric Attention Score and how the score is calculated. Share Add toView InAdd Full Text with ReferenceAdd Description ExportRISCitationCitation and abstractCitation and referencesMore Options Share onFacebookTwitterWechatLinked InRedditEmail Other access optionsGet e-Alertsclose Get e-Alerts

ABSTRACT Eukaryotes carry three types of Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) protein complexes, condensin, cohesin, and SMC5/6, which are ATP-dependent motor proteins that remodel the genome via DNA loop extrusion. SMCs modulate DNA supercoiling, but it has remained incompletely understood how this is achieved. Here we present a single-molecule magnetic tweezers assay that directly measures how much twist is induced by an individual SMC in each loop-extrusion step. We demonstrate that all three SMC complexes induce the same large negative twist (i.e., a linking number change Δ L k of -0.6 at each loop-extrusion step) into the extruded loop, independent of step size. Using ATP-hydrolysis mutants and non-hydrolysable ATP analogues, we find that ATP binding is the twist-inducing event during the ATPase cycle, which coincides with the force-generating loop-extrusion step. The fact that all three eukaryotic SMC proteins induce the same amount of twist indicates a common DNA-loop-extrusion mechanism among these SMC complexes.

Summary Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complexes organize the genome via DNA loop extrusion. While some SMCs were reported to do so symmetrically, reeling DNA from both sides into the extruded DNA loop simultaneously, others perform loop extrusion asymmetrically toward one direction only. The mechanism underlying this variability remains unclear. Here, we examine the directionality of DNA loop extrusion by SMCs using in vitro single-molecule experiments. We find that cohesin and SMC5/6 do not reel in DNA from both sides, as reported before, but instead extrude DNA asymmetrically, while the direction can switch over time. Asymmetric DNA loop extrusion thus is the shared mechanism across all eukaryotic SMC complexes. For cohesin, direction switches strongly correlate with the turnover of the subunit NIPBL, during which DNA strand switching may occur. STAG1 stabilizes NIPBL on cohesin, preventing NIPBL turnover and direction switches. The findings reveal that SMCs, surprisingly, contain a direction switch subunit. Highlights All eukaryotic SMC complexes extrude DNA asymmetrically. Apparent ‘symmetric’ loop extrusion is the result of frequent direction switches. n human cohesin, loop-extrusion direction changes require exchange of NIPBL. STAG1 stabilizes NIPBL on human cohesin.

Abstract Cilia are ubiquitous eukaryotic organelles important to cellular motility, signalling and sensory reception. Cilium formation requires intraflagellar transport for trafficking of structural and signalling components. The large MDa IFT-B complex constitutes the backbone of polymeric IFT trains that carry ciliary cargo between the cilium and the cell body. Currently, high-resolution structures are only available for smaller IFT-B sub-complexes leaving >50% of the IFT-B complex structurally uncharacterized. We have used recent advances in protein structure prediction as implemented in Alphafold to assemble a structural model for the 15-subunit IFT-B complex. The model was validated using crosslinking/MS data on reconstituted IFT-B complexes, X-ray scattering in solution and diffraction from crystals as well as site-directed mutagenesis and protein binding assays. The IFT-B structural model reveals an elongated and highly flexible complex consistent with cryo-electron tomographic reconstructions of IFT trains. The >400Å long IFT-B complex can roughly be divided into IFT-B1 and IFT-B2 parts with binding sites for ciliary cargo and the inactive IFT dynein motor, respectively. Interestingly, our structural modelling and crosslinking/MS results are consistent with two different binding sites for IFT81/74 on IFT88/70/52/46 suggesting the possibility of two different structural architectures for the IFT-B1 complex. Our data present a structural framework to understand IFT-B complex assembly, function, and ciliopathy variants.

Three distinct SMC complexes facilitate chromosome folding and segregation in eukaryotes, presumably by DNA translocation and loop extrusion. How SMCs interact with DNA is however not well understood. Among the SMC complexes, Smc5/6 has dedicated roles in DNA repair and in preventing a lethal buildup of aberrant DNA junctions. Here, we describe the reconstitution of ATP-dependent topological DNA loading by Smc5/6 rings. By inserting cysteine residues at selected protein interfaces, we obtained covalently closed compartments upon chemical cross-linking. We show that two SMC subcompartments and the kleisin compartment topologically entrap a plasmid molecule, but not the full SMC compartment. This is explained by a looped DNA segment inserting into the SMC compartment with the kleisin neck gate locking the loop in place when passing between the two DNA flanks and closing. This DNA segment capture strictly requires the Nse5/6 loader, which opens the neck gate prior to DNA passage. Similar segment capture events without gate opening may provide the power stroke for DNA translocation/loop extrusion in subsequent ATP hydrolysis cycles. Our biochemical experiments thus offer a unifying principle for SMC ATPase function in loading and translocation/extrusion, which is likely relevant to other members of the family of SMC proteins too.

DNA loop-extruding SMC complexes play crucial roles in chromosome folding and DNA immunity. Prokaryotic SMC Wadjet (JET) complexes limit the spread of circular plasmids through DNA cleavage; yet the mechanisms for target recognition are unresolved. We show that artificial DNA circularization renders linear DNA susceptible to JET cleavage. Unlike free DNA, JET cleaves immobilized plasmid DNA at a specific site, the plasmid-anchoring point, showing that the anchor hinders DNA extrusion but not DNA cleavage implying that residual unextruded DNA is cleaved. Structures of plasmid-bound JetABC reveal two presumably stalled SMC motor units that are drastically rearranged from the resting state, together entrapping a U-shaped DNA segment, which is further converted to kinked V-shaped cleavage substrate by JetD nuclease binding. Our findings uncover mechanical bending of residual unextruded DNA as principle for non-self DNA recognition and molecular signature for plasmid cleavage. We elucidate key elements of SMC loop extrusion including motor directionality and the structure of a DNA-holding state.

Multi-subunit protein complexes are at the heart of many cellular processes, and studying their biochemical activities and structures in vitro requires their reconstitution by recombinant expression and purification. Obtaining targets at sufficient purity and scale typically requires the screening of several protein variants and expression hosts. Existing cloning strategies allow to produce constructs for co-expression of proteins, but are often time-consuming, labour-intensive, host-specific, or involving error-prone assembly steps. Here we present a unique set of vectors together with a novel assembly strategy designed to overcome these limitations. It allows for the generation of expression constructs for multi-subunit protein complexes for various hosts in a single cloning step. Its modular nature allows the system to be easily extended to target additional expression hosts or to include new tags or regulatory sequences. As a proof of principle, we present the parallel construction of expression vectors for several Structural Maintenance of Chromosomes (SMC) complexes, allowing us to devise strategies for the recombinant production of these targets in bacteria, insect cells, and human cells, respectively. This work will help laboratories working on protein complexes to streamline their workflow, increase their productivity and improve the quality of the purified material.

Abstract Eukaryotic cells employ three SMC complexes to control DNA folding and topology. The Smc5/6 complex plays roles in DNA repair and in preventing the accumulation of deleterious DNA junctions. To elucidate how specific features of Smc5/6 govern these functions, we reconstituted the yeast holo-complex. We found that the Nse5/6 sub-complex strongly inhibited the Smc5/6 ATPase by preventing productive ATP binding. This inhibition was relieved by plasmid DNA binding but not by short linear DNA, while opposing effects were observed without Nse5/6. We uncovered two binding sites for Nse5/6 on Smc5/6, based on an Nse5/6 crystal structure and cross-linking mass spectrometry data. One binding site is located at the Smc5/6 arms and one at the heads, the latter likely exerting inhibitory effects on ATP hydrolysis. Cysteine cross-linking demonstrated that the interaction with Nse5/6 anchored the ATPase domains in a non-productive state, which was destabilized by ATP and DNA. Under similar conditions, the Nse4/3/1 module detached from the ATPase. Altogether, we show how DNA substrate selection is modulated by direct inhibition of the Smc5/6 ATPase by Nse5/6.

Summary Several vaccines targeting bacterial pathogens show reduced efficacy in the context of intercurrent viral infection indicating a new vaccinology approach is required to protect against such superinfections. To find antigens for the human pathogen Streptococcus pneumoniae that are effective following influenza infection, we performed CRISPRi-seq in a murine model of superinfection and identified the highly conserved lafB gene as virulence factor. We show that LafB is a membrane-associated, intracellular protein that catalyzes the formation of galactosyl-glucosyl-diacylglycerol, a glycolipid we show is important for cell wall homeostasis. Respiratory vaccination with recombinant LafB, in contrast to subcutaneous vaccination, was highly protective against all serotypes in a murine model. In contrast to standard pneumococcal capsule-based conjugate vaccines, protection did not require LafB-specific antibodies but was dependent on airway CD4 + T helper 17 cells. Healthy human individuals can elicit LafB-specific immune responses, suggesting its merit as a universal pneumococcal vaccine antigen that remains effective following influenza infection. One-Sentence Summary Discovery of a universal pneumococcal vaccine protective during superinfection.