Abstract It is unclear how gene order within the chromosome influences bacterial evolution. The genomic location of genes encoding the flow of genetic information is biased towards the replication origin ( oriC ) in fast-growing bacteria. To study the role of chromosomal location on cell physiology we relocated the S10-spec- α locus (S10), harboring half of ribosomal protein genes, to different chromosomal positions in the fast-growing pathogen V. cholerae . We found that growth rate, fitness and infectivity inversely correlated the distance between S10 and oriC . To gain insight into the evolutionary effect of ribosomal protein genomic position, we evolved strains bearing S10 at its current oriC -proximal location or derivatives where the locus far from it, at the chromosomal termini. All populations increased their growth rate along the experiment regardless S10 genomic location. However, the growth rate advantage of an oriC -proximal location persisted along experimental evolution indicating that suppressor mutations cannot compensate S10 genomic position. An increment in biofilm forming capacity was another common trait observed along the experiment. Deep sequencing of populations showed on average 1 mutation fixed each 100 generations, mainly at genes linked to flagellum biosynthesis regulation, lipopolysaccharide synthesis, chemotaxis, biofilm and quorum sensing. We selected fast-growing clones displaying a ∼10% growth rate increment. We found that they harbored inactivating mutations at, among other sites, the flagellum master regulators flrAB . The introduction of these mutations into naïve V. cholerae strains resulted in a ∼10% increase of growth rate. Our study therefore demonstrates that the location of ribosomal protein genes conditions the evolutionary trajectory of growth rate in the long term. While genomic content is highly plastic in prokaryotes, gene order is an underestimated factor that conditions cellular physiology and lineage evolution. The lack of suppression enables artificial gene relocation for genetic circuit reprogramming.

Abstract The possible active entry of aminoglycosides in bacterial cells has been debated since the development of this antibiotic family. Here we report the identification of their active transport mechanism in Vibrio species. We combined genome-wide transcriptional analysis and fitness screens to identify alterations driven by treatment of V. cholerae with sub-minimum inhibitory concentrations (sub-MIC) of the aminoglycoside tobramycin. RNA-seq data showed downregulation of the small non-coding RNA ncRNA586 during such treatment, while Tn-seq revealed that inactivation of this sRNA was associated with improved fitness in the presence of tobramycin. This sRNA is located near sugar transport genes and previous work on a homologous region in Vibrio tasmaniensis suggested that this sRNA stabilizes gene transcripts for carbohydrate transport and utilization, as well as phage receptors. The role for ncRNA586 , hereafter named ctrR , in the transport of both carbohydrates and aminoglycosides, was further investigated. Flow cytometry on cells treated with a fluorescent aminoglycoside confirmed the role of ctrR and of carbohydrate transporters in differential aminoglycoside entry. Despite sequence diversity, ctrR showed functional conservation across the Vibrionales. This system in directly modulated by carbon sources, suggesting regulation by carbon catabolite repression, a widely conserved mechanism in Gram-negative bacteria, priming future research on aminoglycoside uptake by sugar transporters in other bacterial species.

Abstract Ribosomal protein (RP) genes locate near the replication origin ( oriC ) in fast-growing bacteria, which is thought to have been selected as a translation optimization strategy. Relocation of S10-spc-α locus (S10), which codes for most of the RP, to ectopic genomic positions shows that its relative distance to the oriC correlates to a reduction on its dosage, its expression, and bacterial growth rate. Deep-sequencing revealed that S10 relocation altered chromosomal replication dynamics and genome-wide transcription. Such changes increased as a function of oriC -S10 distance. Strikingly, in this work we observed that protein production capacity was independent of S10 position. Since RP constitute a large proportion of cell mass, lower S10 dosage could lead to changes in macromolecular crowding, impacting cell physiology. Accordingly, cytoplasm fluidity was higher in mutants where S10 is most distant from oriC . In hyperosmotic conditions, when crowding differences are minimized, the growth rate and replication dynamics were highly alleviated in these strains. Therefore, on top of its essential function in translation, RP genomic location contributes to sustain optimal macromolecular crowding. This is a novel mechanism coordinating DNA replication with bacterial growth.

Abstract The cellular arrangement and segregation choreography of the genetic material is involved in the timing of assembly and cellular positioning of the cell division apparatus in bacteria. Key to this mode of regulation is the positioning of sister copies of the replication terminus zone ( ter ) of the chromosomes at the end of the replication cycle. The Vibrio cholerae genome is distributed on two chromosomes, ChrI and ChrII. ChrI is derived from the ancestor of the Vibrionales and Enterobacterales. ChrII is derived from a megaplasmid. ChrI encodes for a homologue of MatP, a protein that tethers sister copies of the ter of the Escherichia coli chromosome together at mid-cell at the time of cell division. MatP structures the ter by binding to a ter -specific DNA motif, matS . It forms tetramers that can bridge DNA segments together and it connects sister ter copies to the divisome via an interaction with a cell division protein, ZapB. We find that MatP structures the ter of ChrI and ChrII, ter1 and ter2 , and ensures the cohesion and mid-cell position of sister ter1 and ter2 copies at the time of cell division, demonstrating that ChrII is organised and behaves as a bona fide chromosome. We show that cohesion and positioning are independent of cell division and tetramer formation, but are linked to the local density of matS sites, with sister ter2 separating earlier than sister ter1 because of a lower number of matS sites. Overall, our results suggest that the primary mechanism of action of MatP is to slow down the decatenation of newly replicated molecules.

Vibrio cholerae harbours a primary chromosome derived from the monochromosomal ancestor of the Vibrionales (ChrI) and a secondary chromosome derived from a megaplasmid (ChrII). The coordinated segregation of the replication terminus of both chromosomes (TerI and TerII) determines when and where cell division occurs. ChrI encodes a homologue of Escherichia coli MatP, a protein that binds to a DNA motif (matS) that is overrepresented in replication termini. Here, we use a combination of deep sequencing and fluorescence microscopy techniques to show that V. cholerae MatP structures TerI and TerII into macrodomains, targets them to mid-cell during replication, and delays their segregation, thus supporting that ChrII behaves as a bona fide chromosome. We further show that the extent of the segregation delay mediated by MatP depends on the number and local density of matS sites, and is independent of its assembly into tetramers and any interaction with the divisome, in contrast to what has been previously observed in E. coli. Vibrio cholerae has a primary chromosome and a megaplasmid-derived secondary chromosome. Here, the authors show that protein MatP structures the replication termini of both chromosomes into macrodomains, targets them to mid-cell during replication, and delays their segregation, thus supporting that the secondary chromosome behaves as a bona fide chromosome.

Abstract The replication of the two chromosomes in the pathogenic bacterium Vibrio cholerae is coordinated by the binding of initiator protein RctB to a checkpoint sequence, crtS . Replication of crtS on the primary chromosome (Chr1) triggers replication of the secondary chromosome (Chr2), but the details are poorly understood. Here, we analyze RctB binding patterns in the V. cholerae genome across various cell cycle stages. We find that RctB primarily binds to sites inhibiting replication initiation at the Chr2 origin ( ori2 ). This inhibitory effect is counteracted when crtS is replicated on Chr1, causing a shift in RctB binding to sites that activate replication at ori2 . Structural analyzes indicate the formation of diverse oligomeric states of RctB, coupled to the allosteric effect of DNA, which determine ori2 accessibility. We propose a synchronization model where, upon replication, crtS locally destabilizes the RctB inhibition complex, releasing the Chr2 replication origin.