Colistin is an antibiotic of last resort, but has poor efficacy and resistance is a growing problem. Whilst it is well established that colistin disrupts the bacterial outer membrane (OM) by selectively targeting lipopolysaccharide (LPS), it was unclear how this led to bacterial killing. We discovered that MCR-1 mediated colistin resistance in Escherichia coli is due to modified LPS at the cytoplasmic rather than OM. In doing so, we also demonstrated that colistin exerts bactericidal activity by targeting LPS in the cytoplasmic membrane (CM). We then exploited this information to devise a new therapeutic approach. Using the LPS transport inhibitor murepavadin, we were able to cause LPS accumulation in the CM of Pseudomonas aeruginosa , which resulted in increased susceptibility to colistin in vitro and improved treatment efficacy in vivo. These findings reveal new insight into the mechanism by which colistin kills bacteria, providing the foundations for novel approaches to enhance therapeutic outcomes.

Critical Gram-negative pathogens, like Pseudomonas, Stenotrophomonas and Burkholderia, have become resistant to most antibiotics. Complex resistance profiles together with synergistic interactions between these organisms increase the likelihood of treatment failure in distinct infection settings, for example in the lungs of cystic fibrosis patients. Here, we discover that cell envelope protein homeostasis pathways underpin both antibiotic resistance and cross-protection in CF-associated bacteria. We find that inhibition of oxidative protein folding inactivates multiple species-specific resistance proteins. Using this strategy, we sensitize multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa to β-lactam antibiotics and demonstrate promise of new treatment avenues for the recalcitrant pathogen Stenotrophomonas maltophilia. The same approach also inhibits cross-protection between resistant S. maltophilia and susceptible P. aeruginosa, allowing eradication of both commonly co-occurring CF-associated organisms. Our results provide the basis for the development of next-generation strategies that target antibiotic resistance, while also impairing specific interbacterial interactions that enhance the severity of polymicrobial infections.

Colistin is an antibiotic of last resort for infections caused by drug-resistant Gram-negative pathogens such as Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli . For this reason, high rates of treatment failure and increasing resistance to this antibiotic are very concerning and attempts to resolve these issues are hampered by a poor understanding of colistin’s mode of action. Whilst it is well established that colistin binds to lipopolysaccharide in the bacterial outer membrane, it was unclear how this led to bacterial killing. Here, we show that colistin also targets lipopolysaccharide in the cytoplasmic membrane and that this interaction is essential for cytoplasmic membrane permeabilisation, cell lysis and the bactericidal activity of the antibiotic. We also found that MCR-1-mediated colistin resistance confers protection against the antibiotic via the presence of modified lipopolysaccharide within the cytoplasmic membrane, rather than the outer membrane. These findings reveal key details about the mechanism by which colistin kills bacteria, providing the foundations for the development of new approaches to enhance therapeutic outcomes.

Abstract Colistin is a polymyxin antibiotic of last resort for the treatment of infections caused by multi-drug resistant Gram-negative bacteria. By targeting lipopolysaccharide (LPS), the antibiotic disrupts both the outer and cytoplasmic membranes, leading to lysis and bacterial death. Colistin resistance in Escherichia coli occurs via mutations in the chromosome or the acquisition of mobilised colistin resistance ( mcr ) genes. Both these colistin resistance mechanisms result in chemical modifications to the LPS, with positively charged moieties added at the cytoplasmic membrane before the LPS is transported to the outer membrane. We have previously shown that MCR-1-mediated LPS modification protects the cytoplasmic but not the outer membrane from damage caused by colistin, enabling bacterial survival. However, it remains unclear whether this observation extends to colistin resistance conferred by other mcr genes, or resistance due to chromosomal mutations. Using a panel of clinical E. coli that had acquired mcr -1, -1.5, -2, -3, -3.2 or -5, or had acquired polymyxin resistance independently of mcr genes, we found that almost all isolates were susceptible to colistin-mediated permeabilisation of the outer, but not cytoplasmic, membrane. Furthermore, we showed that permeabilisation of the outer membrane of colistin resistant isolates by the polymyxin is in turn sufficient to sensitise bacteria to the antibiotic rifampicin, which normally cannot cross the LPS monolayer. These findings demonstrate that colistin resistance in E. coli is typically due to protection of the cytoplasmic but not outer membrane from colistin-mediated damage, regardless of the mechanism of resistance.

ABSTRACT Antimicrobial resistance in Gram-negative bacteria is one of the greatest threats to global health. New antibacterial strategies are urgently needed, and the development of antibiotic adjuvants that either neutralize resistance proteins or compromise the integrity of the cell envelope is of ever-growing interest. Most available adjuvants are only effective against specific resistance proteins. Here we demonstrate that disruption of cell envelope protein homeostasis simultaneously compromises several classes of resistance determinants. In particular, we find that impairing DsbA-mediated disulfide bond formation incapacitates diverse β-lactamases and destabilizes mobile colistin resistance enzymes. Furthermore, we show that chemical inhibition of DsbA sensitizes multidrug-resistant clinical isolates to existing antibiotics and that the absence of DsbA, in combination with antibiotic treatment, substantially increases the survival of Galleria mellonella larvae infected with multidrug- resistant Pseudomonas aeruginosa . This work lays the foundation for the development of novel antibiotic adjuvants that function as broad-acting resistance breakers. IMPACT STATEMENT Disruption of disulfide bond formation sensitizes resistant Gram- negative bacteria expressing β-lactamases and mobile colistin resistance enzymes to currently available antibiotics.

ABSTRACT The type VI secretion system (T6SS) is a phage-derived contractile nanomachine primarily involved in interbacterial competition. Its pivotal component, TssA, is indispensable for the assembly of the T6SS sheath structure, the contraction of which propels a payload of effector proteins into neighboring cells. Despite their key function, TssA proteins exhibit unexpected diversity and exist in two major forms, a short (TssA S ) and a long (TssA L ) TssA. Whilst TssA L proteins interact with a partner, called TagA, to anchor the distal end of the extended sheath, the mechanism for the stabilization of TssA S -containing T6SSs remains unknown. Here we discover a novel class of structural components that interact with short TssA proteins and contribute to T6SS assembly by stabilizing the polymerizing sheath from the baseplate. We demonstrate that the presence of these components is important for full sheath extension and optimal firing. Moreover, we show that the pairing of each form of TssA with a different class of sheath stabilization proteins results in T6SS apparatuses that either reside in the cell for a while or fire immediately after sheath extension, thus giving rise to different aggression behaviors. We propose that this functional diversity could contribute to the specialization of the T6SS to suit bacterial lifestyles in diverse environmental niches.

Polymyxin antibiotics are a last-line treatment for multidrug-resistant Gram-negative bacteria. However, the emergence of colistin resistance, including the spread of mobile mcr genes, necessitates the development of improved diagnostics for the detection of colistin-resistant organisms in hospital settings. The recently developed MALDIxin test enables detection of colistin resistance by MALDI-TOF mass spectrometry in less than 15 minutes but is not optimized for the mass spectrometers commonly found in clinical microbiology laboratories. In this study, we adapted the MALDIxin test for the MALDI Biotyper Sirius MALDI-TOF mass spectrometry system (Bruker Daltonics). We optimized the sample preparation protocol using a set of 6 MCR-expressing Escherichia coli clones and validated the assay with a collection of 40 E. coli clinical isolates, including 19 MCR producers, 12 chromosomally-resistant isolates and 9 polymyxin-susceptible isolates. We calculated Polymyxin resistance ratio (PRR) values from the acquired spectra; a PRR value of zero, indicating polymyxin susceptibility, was obtained for all colistin-susceptible E. coli isolates, whereas positive PRR values, indicating resistance to polymyxins, were obtained for all resistant strains independent of the genetic basis of resistance. Thus, we report a preliminary feasibility study showing that an optimized version of the MALDIxin test, adapted for the routine MALDI Biotyper Sirius, provides an unbiased, fast, reliable, cost-effective and high-throughput way of detecting colistin resistance in clinical E. coli isolates.