Abstract Single-cell RNA sequencing is a powerful tool to study developmental biology but does not preserve spatial information about tissue morphology and cellular interactions. Here, we combine single-cell and spatial transcriptomics with algorithms for data integration to study the development of the chicken heart from the early to late four-chambered heart stage. We create a census of the diverse cellular lineages in developing hearts, their spatial organization, and their interactions during development. Spatial mapping of differentiation transitions in cardiac lineages defines transcriptional differences between epithelial and mesenchymal cells within the epicardial lineage. Using spatially resolved expression analysis, we identify anatomically restricted expression programs, including expression of genes implicated in congenital heart disease. Last, we discover a persistent enrichment of the small, secreted peptide, thymosin beta-4, throughout coronary vascular development. Overall, our study identifies an intricate interplay between cellular differentiation and morphogenesis.

Skeletal muscle repair is driven by the coordinated self-renewal and fusion of myogenic stem and progenitor cells. Single-cell gene expression analyses of myogenesis have been hampered by the poor sampling of rare and transient cell states that are critical for muscle repair, and do not inform the spatial context that is important for myogenic differentiation. Here, we demonstrate how large-scale integration of single-cell and spatial transcriptomic data can overcome these limitations. We created a single-cell transcriptomic dataset of mouse skeletal muscle by integration, consensus annotation, and analysis of 23 newly collected scRNAseq datasets and 88 publicly available single-cell (scRNAseq) and single-nucleus (snRNAseq) RNA-sequencing datasets. The resulting dataset includes more than 365,000 cells and spans a wide range of ages, injury, and repair conditions. Together, these data enabled identification of the predominant cell types in skeletal muscle, and resolved cell subtypes, including endothelial subtypes distinguished by vessel-type of origin, fibro-adipogenic progenitors defined by functional roles, and many distinct immune populations. The representation of different experimental conditions and the depth of transcriptome coverage enabled robust profiling of sparsely expressed genes. We built a densely sampled transcriptomic model of myogenesis, from stem cell quiescence to myofiber maturation, and identified rare, transitional states of progenitor commitment and fusion that are poorly represented in individual datasets. We performed spatial RNA sequencing of mouse muscle at three time points after injury and used the integrated dataset as a reference to achieve a high-resolution, local deconvolution of cell subtypes. We also used the integrated dataset to explore ligand-receptor co-expression patterns and identify dynamic cell-cell interactions in muscle injury response. We provide a public web tool to enable interactive exploration and visualization of the data. Our work supports the utility of large-scale integration of single-cell transcriptomic data as a tool for biological discovery.

Spatial transcriptomics reveals the spatial context of gene expression, but current methods are limited to assaying polyadenylated (A-tailed) RNA transcripts. Here we demonstrate that enzymatic in situ polyadenylation of RNA enables detection of the full spectrum of RNAs, expanding the scope of sequencing-based spatial transcriptomics to the total transcriptome. We demonstrate that our spatial total RNA-sequencing (STRS) approach captures coding RNAs, noncoding RNAs and viral RNAs. We apply STRS to study skeletal muscle regeneration and viral-induced myocarditis. Our analyses reveal the spatial patterns of noncoding RNA expression with near-cellular resolution, identify spatially defined expression of noncoding transcripts in skeletal muscle regeneration and highlight host transcriptional responses associated with local viral RNA abundance. STRS requires adding only one step to the widely used Visium spatial total RNA-sequencing protocol from 10x Genomics, and thus could be easily adopted to enable new insights into spatial gene regulation and biology.

Abstract A significant fraction of sudden death in children and young adults is due to viral myocarditis, an inflammatory disease of the heart. In this study, by using integrated single-cell and spatial transcriptomics, we created a high-resolution, spatially resolved transcriptome map of reovirus-induced myocarditis in neonatal mouse hearts. We assayed hearts collected at three timepoints after infection and studied the temporal, spatial and cellular heterogeneity of host–virus interactions. We further assayed the intestine, the primary site of reovirus infection, to establish a full chronology of molecular events that ultimately lead to myocarditis. We found that inflamed endothelial cells recruit cytotoxic T cells and undergo pyroptosis in the myocarditic tissue. Analyses of spatially restricted gene expression in myocarditic regions and the border zone identified immune-mediated cell-type-specific injury and stress responses. Overall, we observed a complex network of cellular phenotypes and spatially restricted cell–cell interactions associated with reovirus-induced myocarditis in neonatal mice.

ABSTRACT Skeletal muscle repair is driven by the coordinated self-renewal and fusion of myogenic stem and progenitor cells. Single-cell gene expression analyses of myogenesis have been hampered by the poor sampling of rare and transient cell states that are critical for muscle repair, and do not provide spatial information that is needed to understand the context in which myogenic differentiation occurs. Here, we demonstrate how large-scale integration of new and public single-cell and spatial transcriptomic data can overcome these limitations. We created a large-scale single-cell transcriptomic dataset of mouse skeletal muscle by integration, consensus annotation, and analysis of 23 newly collected scRNAseq datasets and 79 public single-cell (scRNAseq) and single-nucleus (snRNAseq) RNA-sequencing datasets. The resulting compendium includes nearly 350,000 cells and spans a wide range of ages, injury, and repair conditions. Combined, these data enabled identification of the predominant cell types in skeletal muscle with robust, consensus gene expression profiles, and resolved cell subtypes, including endothelial subtypes distinguished by vessel-type of origin, fibro/adipogenic progenitors marked by stem potential, and many distinct immune populations. The representation of different experimental conditions and the depth of transcriptome coverage enabled robust profiling of sparsely expressed genes. We built a densely sampled transcriptomic model of myogenesis, from stem-cell quiescence to myofiber maturation and identified rare, short-lived transitional states of progenitor commitment and fusion that are poorly represented in individual datasets. We performed spatial RNA sequencing of mouse muscle at three time points after injury and used the integrated dataset as a reference to achieve a high-resolution, local deconvolution of cell subtypes. This analysis identified the temporal variation in the colocalization of immune cell subtype interactions with myogenic progenitors during injury recovery. We provide a public web tool to enable interactive exploration and visualization of this rich single-cell transcriptomic resource. Our work supports the utility of large-scale integration of single-cell transcriptomic data as a tool for biological discovery.

Abstract Conventional scRNA-seq expression analyses rely on the availability of a high quality genome annotation. Yet, as we show here with scRNA-seq experiments and analyses spanning human, mouse, chicken, mole rat, lemur and sea urchin, genome annotations are often incomplete, in particular for organisms that are not routinely studied. To overcome this hurdle, we created a scRNA-seq analysis routine that recovers biologically relevant transcriptional activity beyond the scope of the best available genome annotation by performing scRNA-seq analysis on any region in the genome for which transcriptional products are detected. Our tool generates a single-cell expression matrix for all transcriptionally active regions (TARs), performs single-cell TAR expression analysis to identify biologically significant TARs, and then annotates TARs using gene homology analysis. This procedure uses single-cell expression analyses as a filter to direct annotation efforts to biologically significant transcripts and thereby uncovers biology to which scRNA-seq would otherwise be in the dark.

ABSTRACT A significant fraction of sudden death in children and young adults is due to myocarditis, an inflammatory disease of the heart, most often caused by viral infection. Here we used integrated single-cell and spatial transcriptomics to create a high-resolution, spatially resolved map of reovirus-induced myocarditis in neonatal murine hearts. We assayed hearts collected at three timepoints after reovirus infection and studied the temporal, spatial, and cellular heterogeneity of host-virus interactions. We further assayed the intestine, the primary site of reovirus infection to establish a full chronology of molecular events that ultimately lead to myocarditis. We implemented targeted enrichment of viral transcripts to establish the cellular targets of the virus in the intestine and the heart. Our data give insight into the cell-type specificity of innate immune responses, and into the transcriptional states of inflamed cardiac cells in reovirus-infected heart. We find that inflamed endothelial cells recruit cytotoxic T cells and undergo pyroptosis in the myocarditic tissue. Analyses of spatially restricted gene expression in myocarditic regions and the border zone around those regions identified immune-mediated cell-type specific injury and stress responses. Overall, we observe a dynamic and complex network of cellular phenotypes and cell-cell interactions associated with viral myocarditis.

Abstract Spatial transcriptomics reveals the spatial context of gene expression, but current methods are limited to assaying polyadenylated (A-tailed) RNA transcripts. Here we demonstrate that enzymatic in situ polyadenylation of RNA enables detection of the full spectrum of RNAs, expanding the scope of sequencing-based spatial transcriptomics to the total transcriptome. We apply this Spatial Total RNA-Sequencing (STRS) approach to study skeletal muscle regeneration and viral-induced myocarditis. Our analyses reveal the spatial patterns of noncoding RNA expression with near-cellular resolution, identify spatially defined expression of noncoding transcripts in skeletal muscle regeneration, and highlight host transcriptional responses associated with local viral RNA abundance. In situ polyadenylation requires the addition of only a single step to a widely used protocol for spatial RNA-sequencing, and thus could be broadly and quickly adopted. Spatial RNA-sequencing of the total transcriptome will enable new insights into spatial gene regulation and biology.

Ovulation is essential for reproductive success, yet the underlying cellular and molecular mechanisms are far from clear. Here, we applied high-resolution spatiotemporal transcriptomics to map out cell-type- and ovulation-stage-specific molecular programs as function of time during follicle maturation and ovulation in mice. Our analysis revealed dynamic molecular transitions within granulosa cell types that occur in tight coordination with mesenchymal cell proliferation. We identified new molecular markers for the emerging cumulus cell fate during the preantral-to-antral transition. We describe transcriptional programs that respond rapidly to ovulation stimulation and those associated with follicle rupture, highlighting the prominent roles of apoptotic and metabolic pathways during the final stages of follicle maturation. We further report stage-specific oocyte-cumulus cell interactions and diverging molecular differentiation in follicles approaching ovulation. Collectively, this study provides insights into the cellular and molecular processes that regulate mouse ovarian follicle maturation and ovulation with important implications for advancing therapeutic strategies in reproductive medicine.

ABSTRACT Single-cell RNA sequencing is a powerful tool to study developmental biology but does not preserve spatial information about cellular interactions and tissue morphology. Here, we combined single-cell and spatial transcriptomics with new algorithms for data integration to study the early development of the chicken heart. We collected data from four key ventricular development stages, ranging from the early chamber formation stage to the late four-chambered stage. We created an atlas of the diverse cellular lineages in developing hearts, their spatial organization, and their interactions during development. Spatial mapping of differentiation transitions revealed the intricate interplay between cellular differentiation and morphogenesis in cardiac cellular lineages. Using spatially resolved expression analysis, we identified anatomically restricted gene expression programs. Last, we discovered a stage-dependent role for the small secreted peptide, thymosin beta-4, in the coordination of multi-lineage cellular populations. Overall, our study identifies key stage-specific regulatory programs that govern cardiac development.