The development of biomaterials capable of regulating cellular processes and guiding cell fate decisions has broad implications in tissue engineering, regenerative medicine, and cell-based assays for drug development and disease modeling. Recent studies have shown that three-dimensional (3D) nanoscale physical cues such as nanotopography can modulate various cellular processes like adhesion and endocytosis by inducing nanoscale curvature on the plasma and nuclear membranes. Two-dimensional (2D) biochemical cues such as protein micropatterns can also regulate cell function and fate by controlling cellular geometries. Development of biomaterials with precise control over nanoscale physical and biochemical cues can significantly influence programming cell function and fate. In this study, we utilized a laser-assisted micropatterning technique to manipulate the 2D architectures of cells on 3D nanopillar platforms. We performed a comprehensive analysis of cellular and nuclear morphology and deformation on both nanopillar and flat substrates. Our findings demonstrate the precise engineering of single cell architectures through 2D micropatterning on nanopillar platforms. We show that the coupling between the nuclear and cell shape is disrupted on nanopillar surfaces compared to flat surfaces. Furthermore, our results suggest that cell elongation on nanopillars enhances nanopillar-induced endocytosis. We believe our platform serves as a versatile tool for further explorations into programming cell function and fate through combined physical cues that create nanoscale curvature on cell membranes and biochemical cues that control the geometry of the cell.

Abstract Morphogenesis requires building stable macromolecular structures from highly dynamic proteins. Muscles are anchored by long-lasting integrin adhesions to resist contractile force. However, the mechanisms governing integrin diffusion, immobilization, and activation within developing tissues remain elusive. Here, we show that actin polymerisation-driven membrane protrusions form nanotopographies that enable strong adhesion at Drosophila muscle attachment sites (MAS). Super-resolution microscopy revealed that integrins assemble adhesive belts around Arp2/3-dependent actin protrusions, forming invadosome-like structures with membrane nanotopographies. Single protein tracking showed that, during MAS development, integrins became immobile and confined within diffusion traps formed by the membrane nanotopographies. Actin filaments also displayed restricted motion and confinement, indicating strong mechanical connection with integrins. Using isolated muscles cells, we show that substrate nanotopography, rather than rigidity, drives adhesion maturation by regulating actin protrusion, integrin diffusion and immobilization. These results thus demonstrate that actin-polymerisation driven membrane protrusions are essential for the formation of strong integrin adhesions sites in the developing embryo, and highlight the important contribution of geometry to morphogenesis.

Abstract Mammalian cells adhere to the extracellular matrix (ECM) and sense mechanical cues through integrin-mediated adhesions 1, 2 . Focal adhesions and related structures are the primary architectures that transmit forces between the ECM and the actin cytoskeleton. Although focal adhesions are abundant when cells are cultured on rigid substrates, they are sparse in soft environments that cannot support high mechanical tensions 3 . Here, we report a new class of integrin-mediated adhesions, curved adhesions, whose formation is regulated by membrane curvature instead of mechanical tension. In soft matrices made of protein fibres, curved adhesions are induced by membrane curvatures imposed by the fibre geometry. Curved adhesions are mediated by integrin ɑVβ5 and are molecularly distinct from focal adhesions and clathrin lattices. The molecular mechanism involves a previously unknown interaction between integrin β5 and a curvature-sensing protein FCHo2. We find that curved adhesions are prevalent in physiologically relevant environments. Disruption of curved adhesions by knocking down integrin β5 or FCHo2 abolishes the migration of multiple cancer cell lines in 3D matrices. These findings provide a mechanism of cell anchorage to natural protein fibres that are too soft to support the formation of focal adhesions. Given their functional importance for 3D cell migration, curved adhesions may serve as a therapeutic target for future development.

Contact sites between the endoplasmic reticulum (ER) and the plasma membrane (PM) play a crucial role in governing calcium regulation and lipid homeostasis. Despite their significance, the factors regulating their spatial distribution on the PM remain elusive. Inspired by observations in cardiomyocytes, where ER-PM contact sites concentrate on tubular PM invaginations known as transverse tubules (T-tubules), we hypothesize that the PM curvature plays a role in ER-PM contact formation. Through precise control of PM invaginations, we show that PM curvatures locally induce the formation of ER-PM contacts in cardiomyocytes. Intriguingly, the junctophilin family of ER-PM tethering proteins, specifically expressed in excitable cells, is the key player in this process, while the ubiquitously expressed extended synaptotagmin 2 does not show a preference for PM curvature. At the mechanistic level, we find that the low complexity region (LCR) and the MORN motifs of junctophilins can independently bind to the PM, but both the LCR and MORN motifs are required for targeting PM curvatures. By examining the junctophilin interactome, we identify a family of curvature-sensing proteins, Eps15-homology domain containing proteins (EHDs), that interact with the MORN_LCR motifs and facilitate junctophilins' preferential tethering to curved PM. These findings highlight the pivotal role of PM curvature in the formation of ER-PM contacts in cardiomyocytes and unveil a novel mechanism for the spatial regulation of ER-PM contacts through PM curvature modulation.

ABSTRACT Platforms with nanoscale topography have recently become powerful tools in cellular biophysics and bioengineering. Recent studies have shown that nanotopography affects various cellular processes like adhesion and endocytosis, as well as physical properties such as cell shape. To engineer nanopillars more effectively for biomedical applications, it is crucial to gain better control and understanding of how nanopillars affect cell and nuclear physical properties, such as shape and spreading area, and impact cellular processes like endocytosis and adhesion. In this study, we utilized a laser-assisted micropatterning technique to manipulate the 2D architectures of cells on 3D nanopillar platforms. We performed a comprehensive analysis of cellular and nuclear morphology and deformation on both nanopillar and flat substrates. Our findings demonstrate precise engineering of cellular architectures through 2D micropatterning on nanopillar platforms. We show that the coupling between nuclear and cell shape is disrupted on nanopillar surfaces compared to flat surfaces. Furthermore, we discovered that cell elongation on nanopillars enhances nanopillar-induced endocytosis. These results have significant implications for various biomedical applications of nanopillars, including drug delivery, drug screening, intracellular electrophysiology, and biosensing. We believe our platform serves as a versatile tool for further explorations, facilitating investigations into the interplay between cell physical properties and alterations in cellular processes. Graphical Abstract

Abstract Both substrate stiffness and surface topography regulate cell behavior through mechanotransduction signaling pathways. Such intertwined effects suggest that engineered surface topographies might substitute or cancel the effects of substrate stiffness in biomedical applications. However, the mechanisms by which cells recognize topographical features are not fully understood. Here we demonstrate that the presence of nanotopography drastically alters cell behavior such that neurons and stem cells cultured on rigid glass substrates behave as if they were on soft hydrogels. We further show that rigid nanotopography resembles the effect of soft hydrogels in reducing cell stiffness and membrane tension as measured by atomic force microscopy. Finally, we demonstrate that nanotopography reduces focal adhesions and cell stiffness by enhancing the endocytosis and the subsequent removal of integrin receptors. This mechanistic understanding will support the rational design of nanotopography that directs cells on rigid materials to behave as if they were on soft ones. TOC graphic

Abstract Plasma membrane topography has been shown to strongly influence the behavior of many cellular processes such as clathrin-mediated endocytosis, actin rearrangements, and others. Recent studies have used 3D nanostructures such as nanopillars to imprint well-defined membrane curvatures (the “nano-bio interface”). In these studies, proteins and their interactions were probed by 2D fluorescence microscopy. However, the low resolution and limited axial detail of such methods are not optimal to determine the relative spatial position and distribution of proteins along a 100 nm-diameter object, which is below the optical diffraction limit. Here, we introduce a general method to explore the nanoscale distribution of proteins at the nano-bio interface with 10-20 nm precision using 3D single-molecule super-resolution (SR) localization microscopy. This is achieved by combining a silicone oil immersion objective and 3D double-helix point-spread function microscopy. We carefully optimize the objective to minimize spherical aberrations between quartz nanopillars and the cell. To validate the 3D SR method, we imaged the 3D shape of surface-labeled nanopillars and compared the results with electron microscopy measurements. Turning to transmembrane-anchored labels in cells, the high quality 3D SR reconstructions reveal the membrane tightly wrapping around the nanopillars. Interestingly, the cytoplasmic protein AP-2 involved in clathrin-mediated endocytosis accumulates along the nanopillar above a specific threshold of 1/R membrane curvature. Finally, we observe that AP-2 and actin preferentially accumulate at positive Gaussian curvature near the pillar caps. Our results establish a general method to investigate the nanoscale distribution of proteins at the nano-bio interface using 3D SR microscopy.

Organoids and assembloids have emerged as a promising platform to model aspects of nervous system development. Longterm, minimally-invasive recordings in these multi-cellular systems are essential for developing disease models. Current technologies, such as patch-clamp, penetrating microelectrodes, planar electrode arrays and substrate-attached flexible electrodes, do not, however, allow chronic recording of organoids in suspension, which is necessary to preserve their architecture. Inspired by the art of kirigami, we developed flexible electronics that transition from a 2D pattern to a 3D basketlike configuration to accommodate the long-term culture of organoids in suspension. This platform, named kirigami electronics (KiriE), integrates with and enables chronic recording of cortical organoids while preserving morphology, cytoarchitecture, and cell composition. KiriE can be integrated with optogenetic and pharmacological stimulation and model disease. Moreover, KiriE can capture activity in cortico-striatal assembloids. Moving forward, KiriE could reveal disease phenotypes and activity patterns underlying the assembly of the nervous system.

Abstract Drug-induced cardiotoxicity arises primarily when a compound alters the electrophysiological properties of cardiomyocytes. Features of intracellular action potentials (iAPs) are powerful biomarkers that predict proarrhythmic risks. However, the conventional patch clamp techniques for measuring iAPs are either laborious and low throughput or not suitable for measuring electrically connected cardiomyocytes. In the last decade, a number of vertical nanoelectrodes have been demonstrated to achieve parallel and minimally-invasive iAP recordings. Nanoelectrodes show great promise, but the large variability in success rate, signal strength, and the low throughput of device fabrication have hindered them from being broadly adopted for proarrhythmia drug assessment. In this work, we developed vertically-aligned and semi-hollow nanocrown electrodes that are mechanically robust and made through a scalable fabrication process. Nanocrown electrodes achieve >99% success rates in obtaining intracellular access through electroporation, allowing reliable and simultaneous iAP recordings from up to 57 human pluripotent stem-cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs). The accuracy of nanocrown electrode recordings is validated by simultaneous patch clamp recording from the same cell. Nanocrown electrodes enable prolonged iAP recording for continual monitoring of the same cells upon the sequential addition of four to five incremental drug doses. In this way, the dose-response data is self-referencing, which avoids the cell-to-cell variations inherent to hPSC-CMs. We are hopeful that this technology development is a step towards establishing an iAP screening assay for preclinical evaluation of drug-induced arrhythmogenicity.