Abstract The Iberian ribbed newt ( Pleurodeles waltl ) constitutes a central model for probing the basis of vertebrate regeneration. Here, we present the sequencing and chromosome-scale assembly of the 20.3Gb P. waltl genome, which exhibits the highest level of contiguity and completeness among giant genome assemblies. We uncover that DNA transposable elements are the major contributors to its expansion, with hAT transposons comprising a large portion of repeats. Several hATs are actively transcribed and differentially expressed during adult P. waltl limb regeneration, along with domesticated hAT transposons of the ZBED transcription factor family. Despite its size, syntenic relationships are conserved. As an example, we show the high degree of conservation of the regeneration-associated Tig1 locus with several neighbouring genes. Together, the P. waltl genome provides a fundamental resource for the study of regenerative, developmental and evolutionary principles.

Abstract Mammalian gene expression patterns are controlled by regulatory elements, which interact within Topologically Associating Domains (TADs). The relationship between activation of regulatory elements, formation of structural chromatin interactions and gene expression during development is unclear. We developed Tiled-C, a low-input Chromosome Conformation Capture (3C) approach, to study chromatin architecture at high spatial and temporal resolution through in vivo mouse erythroid differentiation. Integrated analysis of matched chromatin accessibility and single-cell expression data shows that regulatory elements gradually become accessible within pre-existing TADs during early differentiation. This is followed by structural re-organization within the TAD and formation of specific contacts between enhancers and promoters. In contrast to previous reports, our high-resolution data show that these enhancer-promoter interactions are not established prior to gene expression, but formed gradually during differentiation, concomitant with progressive upregulation of gene activity. Together, these results provide new insight into the close, interdependent relationship between chromatin architecture and gene regulation during development.

Abstract There is a wealth of data indicating human bone marrow derived stromal cells (HBMSCs) contain the skeletal stem cell (SSC) with the potential to differentiate along the stromal osteogenic, adipogenic and chondrogenic lineages. However, despite these advances, current methods to isolate skeletal stem cells (SSCs) from human tissues have proved challenging as no single specific marker has been identified limiting understanding of SSC fate, immunophenotype and the widespread clinical application of these cells. While a number of cell surface markers can enrich for SSCs, none of the proposed markers, alone, provide a platform to isolate single cells with the ability to form bone, cartilage, and adipose tissue in humans. The current study details the application of oligonucleotide-coated nanoparticles, spherical nucleic acids (SNAs), to rapidly isolate human cells using mRNAs signatures detected in SSCs in real time, to identify stem and progenitor skeletal populations using single cell RNA sequencing. Based on scRNA-seq of samples from 11 patients, this method was able to identify novel targets for SSC enrichment, which were assessed in a total of 80 patients. This methodology was able to isolate potential SSCs found at a frequency of <1 in 1,000,000 in human bone marrow, with a capacity for tri-lineage differentiation in vitro . The current approach provides new targets and a platform to advance SSC isolation, enrichment with significant therapeutic impact therein.

Abstract Spt4 is a transcription elongation factor, with homologues in organisms with nucleosomes. Structural and in vitro studies implicate Spt4 in transcription through nucleosomes, yet the in vivo function of Spt4 is unclear. Here we assessed the precise position of Spt4 during transcription and the consequences of loss of Spt4 on RNA polymerase II (RNAPII) dynamics and nucleosome positioning in Saccharomyces cerevisiae . In the absence of Spt4, the spacing between gene-body nucleosomes increases and RNAPII accumulates upstream of the nucleosomal dyad, most dramatically at nucleosome +2. Spt4 associates with elongating RNAPII early in transcription and its association dynamically changes depending on nucleosome positions. Together, our data show that Spt4 regulates early elongation dynamics, participates in co-transcriptional nucleosome positioning, and promotes RNAPII movement through the gene-body nucleosomes, especially the +2 nucleosome.

A genomic database of all Earth's eukaryotic species could contribute to many scientific discoveries; however, only a tiny fraction of species have genomic information available. In 2018, scientists across the world united under the Earth BioGenome Project (EBP), aiming to produce a database of high-quality reference genomes containing all ~1.5 million recognized eukaryotic species. As the European node of the EBP, the European Reference Genome Atlas (ERGA) sought to implement a new decentralised, equitable and inclusive model for producing reference genomes. For this, ERGA launched a Pilot Project establishing the first distributed reference genome production infrastructure and testing it on 98 eukaryotic species from 33 European countries. Here we outline the infrastructure and explore its effectiveness for scaling high-quality reference genome production, whilst considering equity and inclusion. The outcomes and lessons learned provide a solid foundation for ERGA while offering key learnings to other transnational, national genomic resource projects and the EBP.

Advances in long-read sequencing technology have shifted a key challenge in biodiversity genomics from DNA sequencing and genome assembly to obtaining suitable samples. Although flash-frozen samples remain the gold standard, they are often unattainable. In contrast, natural history collections worldwide harbor millions of ethanol-preserved samples, but such samples remain largely unutilized for long-read sequencing. Here, we use ethanol-preserved samples containing kilobase-sized DNA to show that amplification-free long-read sequencing can yield contiguous genome assemblies, which we exemplify using two catfish species. For other samples, where amplification-free protocols failed, we show that a modified protocol employing an alternative polymerase can successfully overcome issues related to long-read sequencing and PCR bias. For the maned sloth Bradypus torquatus, we demonstrate that this modified protocol together with long-range HiC data achieves a high-quality chromosome-level assembly of its 3.1 Gb genome, surpassing the previous 500 Mb genome size limit of the previous protocol. Moreover, our modified protocol also improves assembly quality and completeness for various other species that require amplification because of low sequencing performance or very small DNA amounts in tiny millimeter-sized organisms. Together, by highlighting collections as valuable but underexplored sample resources for long-read sequencing and by facilitating genome assemblies of small and challenging organisms, our study advances biodiversity genomics and global efforts to obtain reference genomes of all eukaryotes.

Abstract Genomes are pervasively transcribed leading to stable and unstable transcripts that define functional regions of genomes and contribute to cellular phenotypes. Defining comprehensive nascent transcriptomes is pivotal to understand gene regulation, disease processes, and the impact of extracellular signals on cells. However, currently employed methods are laborious, technically challenging and costly. We developed s ingle- n ucleotide resolution 4s U -sequencing (SNU-Seq), involving pulse labelling, biotinylation and direct isolation of nascent transcripts. Artificial poly-(A)-tailing of the 3’ most nucleotide of nascent transcripts ensures oligo-d(T) primer-based library preparation and sequencing using commercial 3’ RNA-Seq kits. We show that SNU-Seq is a cost-effective new method generating even read profiles across transcription units. We used SNU-Seq to identify transcription elongation parameters, to map usage of polyadenylation (PAS) sites and novel enhancers. Remarkably, 4sU labelled nascent RNA accumulates short ∼100nt transcripts that map to the 5’ end of genes. We show that isolation of these short nascent RNA and sequencing the 5’ and 3’ ends using s ize- s elected SNU-Seq (ssSNU-Seq) provides highly sensitive annotations of mapped and novel TSSs, promoter-proximal pause/termination sites. Thus, SNU-seq and ssSNU-seq combined yield comprehensive transcriptomics data at low cost with high spatial and temporal resolution. Highlights - SNU-Seq maps nascent transcripts at base-pair resolution, with high sensitivity and low cost - SNU-Seq detects comprehensive polyadenylation sites. - SNU-Seq maps the promoter proximal pause 60-80 nt from the TSS. - Size-selected SNU-Seq yields highly sensitive and novel TSS annotations

Abstract Feeding exclusively on blood, vampire bats represent the only obligate sanguivorous lineage among mammals. To uncover genomic changes associated with adaptations to this unique dietary specialization, we generated a new haplotype-resolved reference-quality genome of the common vampire bat ( Desmodus rotundus ) and screened 26 bat species for genes that were specifically lost in the vampire bat lineage. We discovered previously-unknown gene losses that relate to metabolic and physiological changes, such as reduced insulin secretion ( FFAR1 , SLC30A8 ), limited glycogen stores ( PPP1R3E ), and a distinct gastric physiology ( CTSE ). Other gene losses likely reflect the biased nutrient composition ( ERN2 , CTRL ) and distinct pathogen diversity of blood ( RNASE7 ). Interestingly, the loss of REP15 likely helped vampire bats to adapt to high dietary iron levels by enhancing iron excretion and the loss of the 24S-hydroxycholesterol metabolizing enzyme CYP39A1 could contribute to their exceptional cognitive abilities. Finally, losses of key cone phototransduction genes ( PDE6H , PDE6C ) suggest that these strictly-nocturnal bats completely lack cone-based vision. These findings enhance our understanding of vampire bat biology and the genomic underpinnings of adaptations to sanguivory.

We present a complete, chromosome-scale reference genome for the long-distance migratory bat Pipistrellus nathusii. The genome encompasses both haplotypic sets of autosomes and the separation of both sex chromosomes by utilizing highly accurate long-reads and preserving long-range phasing information through the use of three-dimensional chromatin conformation capture sequencing (Hi-C). This genome, accompanied by a comprehensive protein-coding sequence annotation, provides a valuable genomic resource for future investigations into the genomic bases of long-distance migratory flight in bats as well as uncovering the genetic architecture, population structure and evolutionary history of Pipistrellus nathusii. The reference-quality genome presented here gives a fundamental resource to further our understanding of bat genetics and evolution, adding to the growing number of high-quality genetic resources in this field. Here, we demonstrate its use in the phylogenetic reconstruction of the order Chiroptera, and in particular, we present the resources to allow detailed investigations into the genetic drivers and adaptations related to long-distance migration.

The planarian Schmidtea mediterranea is being studied as a model species for regeneration, but the assembly of planarian genomes remains challenging. Here, we report a high-quality haplotype-phased, chromosome-scale genome assembly of the sexual S2 strain of S. mediterranea and high-quality chromosome-scale assemblies of its three close relatives, S. polychroa, S. nova, and S. lugubris. Using hybrid gene annotations and optimized ATAC-seq and ChIP-seq protocols for regulatory element annotation, we provide valuable genome resources for the planarian research community and a first comparative perspective on planarian genome evolution. Our analyses reveal substantial divergence in protein-coding sequences and regulatory regions but considerable conservation within promoter and enhancer annotations. We also find frequent retrotransposon-associated chromosomal inversions and interchromosomal translocations within the genus Schmidtea and, remarkably, independent and nearly complete losses of ancestral metazoan synteny in Schmidtea and two other flatworm groups. Overall, our results suggest that platyhelminth genomes can evolve without syntenic constraints.