Expansion of the polyglutamine repeat within the protein Huntingtin (Htt) causes Huntington's disease, a neurodegenerative disease associated with aging and the accumulation of mutant Htt in diseased neurons. Understanding the mechanisms that influence Htt cellular degradation may target treatments designed to activate mutant Htt clearance pathways. We find that Htt is phosphorylated by the inflammatory kinase IKK, enhancing its normal clearance by the proteasome and lysosome. Phosphorylation of Htt regulates additional post-translational modifications, including Htt ubiquitination, SUMOylation, and acetylation, and increases Htt nuclear localization, cleavage, and clearance mediated by lysosomal-associated membrane protein 2A and Hsc70. We propose that IKK activates mutant Htt clearance until an age-related loss of proteasome/lysosome function promotes accumulation of toxic post-translationally modified mutant Htt. Thus, IKK activation may modulate mutant Htt neurotoxicity depending on the cell's ability to degrade the modified species.

Significance The normal function of the Huntingtin (HTT) protein is emerging. Here we report that selective autophagy requires an intact HTT protein in Drosophila and mouse CNS. We describe similarities in structure and binding activity between the C-terminal domain of HTT and the yeast autophagy scaffold protein Atg11, suggesting that HTT may normally function as a scaffold for various types of selective autophagy. Mice expressing an expanded repeat form of HTT also show deficits in protein clearance. Because autophagy is critical for clearance of cellular proteins, including mutant HTT, the impairment of normal HTT function by the polyQ expansion could suppress activity of the autophagy machinery. These results may have important implications when evaluating therapeutic strategies for HD.

Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disorder caused by a CAG repeat expansion in the first exon of the HTT gene encoding huntingtin. Prior reports have established a correlation between CAG expanded HTT and altered gene expression. However, the mechanisms leading to disruption of RNA processing in HD remain unclear. Here, our analysis of the reported HTT protein interactome identifies interactions with known RNA-binding proteins (RBPs). Total, long-read sequencing and targeted RASL-seq of RNAs from cortex and striatum of the HD mouse model R6/2 reveals increased exon skipping which is confirmed in Q150 and Q175 knock-in mice and in HD human brain. We identify the RBP TDP-43 and the N6-methyladenosine (m6A) writer protein methyltransferase 3 (METTL3) to be upstream regulators of exon skipping in HD. Along with this novel mechanistic insight, we observe decreased nuclear localization of TDP-43 and cytoplasmic accumulation of phosphorylated TDP-43 in HD mice and human brain. In addition, TDP-43 co-localizes with HTT in human HD brain forming novel nuclear aggregate-like bodies distinct from mutant HTT inclusions or previously observed TDP-43 pathologies. Binding of TDP-43 onto RNAs encoding HD-associated differentially expressed and aberrantly spliced genes is decreased. Finally, m6A RNA modification is reduced on RNAs abnormally expressed in striatum from HD R6/2 mouse brain, including at clustered sites adjacent to TDP-43 binding sites. Our evidence supports TDP-43 loss of function coupled with altered m6A modification as a novel mechanism underlying alternative splicing/unannotated exon usage in HD and highlights the critical nature of TDP-43 function across multiple neurodegenerative diseases.

Abstract The complexity of affected brain regions and cell types is a challenge for Huntington’s disease (HD) treatment. Here we used single nucleus RNA sequencing (snRNAseq) to investigate mechanism of pathology in the cortex and striatum from R6/2 mice at 8 and 12w and in three regions of human HD post-mortem tissue. We identified cell type-specific and cell agnostic signatures and found changes suggesting oligodendrocytes (OLs) and oligodendrocyte precursors (OPCs) were arrested in intermediate maturation states. OL-lineage regulators OLIG1 and OLIG2 were negatively correlated with CAG length in human OPCs, and ATACseq analysis of HD mouse NeuN-negative cells showed decreased accessibility of sites regulated by OL maturation genes. Glucose and lipid metabolism were implicated in abnormal cell maturation and PRKCE and Thiamine Pyrophosphokinase 1 were identified as central genes. High dose thiamine/biotin treatment of R6/1 HD mice to target thiamine metabolism not only restored OL maturation, but also rescued pathology in neurons. These findings reveal insights into HD OL pathology that spans multiple brain regions and link OL maturation deficits to abnormal thiamine metabolism.

Understanding the normal function of the Huntingtin (HTT) protein is of significance in the design and implementation of therapeutic strategies for Huntington’s disease (HD). Expansion of the CAG repeat in the HTT gene, encoding an expanded polyglutamine (polyQ) repeat within the HTT protein, causes HD and may compromise HTT’s normal activity contributing to HD pathology. Here, we investigated the previously defined role of HTT in autophagy specifically through studying HTT’s association with ubiquitin. We find that HTT interacts directly with ubiquitin in vitro. Tandem affinity purification was used to identify ubiquitinated and ubiquitin-associated proteins that copurify with a HTT N-terminal fragment under basal conditions. Copurification is enhanced by HTT polyQ expansion and reduced by mimicking HTT serine 421 phosphorylation. The identified HTT-interacting proteins include RNA-binding proteins (RBPs) involved in mRNA translation, proteins enriched in stress granules, the nuclear proteome, the defective ribosomal products (DRiPs) proteome and the brain-derived autophagosomal proteome. To determine whether the proteins interacting with HTT are autophagic targets, HTT knockout (KO) cells and immunoprecipitation of lysosomes were used to investigate autophagy in the absence of HTT. HTT KO was associated with reduced abundance of mitochondrial proteins in the lysosome, indicating a potential compromise in basal mitophagy, and increased lysosomal abundance of RBPs which may result from compensatory up-regulation of starvation-induced macroautophagy. We suggest HTT is critical for appropriate basal clearance of mitochondrial proteins and RBPs, hence reduced HTT proteostatic function with mutation may contribute to the neuropathology of HD.

Abstract Huntington’s disease (HD), a genetic neurodegenerative disorder, primarily impacts the striatum and cortex with progressive loss of medium-sized spiny neurons (MSNs) and pyramidal neurons, disrupting cortico-striatal circuitry. A promising regenerative therapeutic strategy of transplanting human neural stem cells (hNSCs) is challenged by the need for long-term functional integration. We previously described that hNSCs transplanted into the striatum of HD mouse models differentiated into electrophysiologically active immature neurons, improving behavior and biochemical deficits. Here we show that 8-month implantation of hNSCs into the striatum of zQ175 HD mice ameliorates behavioral deficits, increases brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and reduces mutant Huntingtin (mHTT) accumulation. Patch clamp recordings, immunohistochemistry and electron microscopy demonstrates that hNSCs differentiate into diverse neuronal populations, including MSN- and interneuron-like cells. Remarkably, hNSCs receive synaptic inputs, innervate host neurons, and improve membrane and synaptic properties. Overall, the findings support hNSC transplantation for further evaluation and clinical development for HD.

Summary Huntington’s disease (HD) is a neurodegenerative disease caused by an expanded CAG repeat within the Huntingtin ( HTT ) gene having dysregulated cellular homeostasis in the central nervous system, particularly in the striatum and cortex. Astrocytes establish and maintain neuronal functions through the secretion of soluble factors and physical interactions with other neurovascular unit cell types. Under pathological conditions, astrocytes can become reactive, causing cell state transitions that affect brain function. To investigate transitions between cellular states in unaffected and HD astrocytes at high resolution, single-nuclei RNA-sequencing (snRNA-seq) was performed on human HD patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived astrocytes and on striatal and cortical tissue from a rapidly progressing HD mouse model (R6/2). Analysis of HD human and mouse astrocytes revealed both models have alterations in morphology, glutamate uptake, and dysregulation of astrocyte identity and maturation, whereas dysregulated actin-mediated signaling was unique to human iPSC-derived astrocytes. Representative proteins showed altered levels by Western. In both species, HD transcriptional changes reveal potential astrocyte maturation deficits that were potentially driven by astrogliogenesis transcription factors, including ATF3 and NFIA. When perturbed in a drosophila model of HD, knockdown of NFIA in glia rescued the climbing deficit. These data further support the hypothesis that mutant HTT induces dysregulated astrocyte cell states resulting in dysfunctional astrocytic properties, suggests that some of these states are cell autonomous and maybe unique to human HD, and implicate ATF3 and maturation deficits in HD pathogenesis.