Two fundamental aims that emerge when analyzing single-cell RNA-seq data are that of identifying which genes vary in an informative manner and determining how these genes organize into modules. Here we propose a general approach to these problems that operates directly on a given metric of cell-cell similarity, allowing for its integration with any method (linear or non linear) for identifying the primary axes of transcriptional variation between cells. Additionally, we show that when using multi-modal data, our procedure can be used to identify genes whose expression reflects alternative notions of similarity between cells, such as physical proximity in a tissue or clonal relatedness in a cell lineage tree. In this manner, we demonstrate that while our method, called Hotspot , is capable of identifying genes that reflect nuanced transcriptional variability between T helper cells, it can also identify spatially-dependent patterns of gene expression in the cerebellum as well as developmentally-heritable expression signatures during embryogenesis.

Cellular metabolism, a key regulator of immune responses, is difficult to study with current technologies in individual cells Here, we present Compass, an algorithm to characterize the metabolic state of cells based on single-cell RNA-Seq and flux balance analysis. We applied Compass to associate metabolic states with functional variability (pathogenic potential) amongst Th17 cells and recovered a metabolic switch between glycolysis and fatty acid oxidation, akin to known differences between Th17 and Treg cells, as well as novel targets in amino-acid pathways, which we tested through targeted metabolic assays. Compass further predicted a particular glycolytic reaction (phosphoglycerate mutase — PGAM) that promotes an anti-inflammatory Th17 phenotype, contrary to the common understanding of glycolysis as pro-inflammatory. We demonstrate that PGAM inhibition leads non-pathogenic Th17 cells to adopt a pro-inflammatory transcriptome and induce autoimmunity in vivo. Compass is broadly applicable for characterizing metabolic states of cells and relating metabolic heterogeneity to other cellular phenotypes.

Cellular metabolism can orchestrate immune cell function. We previously demonstrated that lipid biosynthesis represents one such gatekeeper to Th17 cell functional state. Utilizing Compass, a transcriptome-based algorithm for prediction of metabolic flux, we constructed a comprehensive metabolic circuitry for Th17 cell function and identified the polyamine pathway as a candidate metabolic node, the flux of which regulates the inflammatory function of T cells. Testing this prediction, we found that expression and activities of enzymes of the polyamine pathway were enhanced in pathogenic Th17 cells and suppressed in regulatory T cells. Perturbation of the polyamine pathway in Th17 cells suppressed canonical Th17 cell cytokines and promoted the expression of Foxp3, accompanied by dramatic shift in transcriptome and epigenome, transitioning Th17 cells into a Treg-like state. Genetic and chemical perturbation of the polyamine pathway resulted in attenuation of tissue inflammation in an autoimmune disease model of central nervous system, with changes in T cell effector phenotype.

Summary The cytokine receptor IL-23R plays a fundamental role in inflammation and autoimmunity. However, several observations have been difficult to reconcile under the assumption that only Th17 cells critically depend on IL-23 to acquire a pathogenic phenotype. Here, we report that Th1 cells differentiated in vitro with IL-12 + IL-21 show similar levels of IL-23R expression as in pathogenic Th17 cells. We demonstrate that IL-23R is required for Th1 cells to acquire a highly colitogenic phenotype. scRNAseq analysis of intestinal T cells enabled us to identify novel regulators induced by IL-23R-signaling in Th1 cells which differed from those expressed in Th17 cells. The perturbation of one of these regulators (CD160) in Th1 cells inhibited induction of colitis. In this process, we were able to uncouple IL-23R as a purely Th17 cell-specific factor and implicate IL-23R signaling as a pathogenic driver of Th1 cell-mediated tissue inflammation and disease.

Background: A key challenge in the emerging field of single-cell RNA-Seq is to characterize phenotypic diversity between cells and visualize this information in an informative manner. A common technique when dealing with high-dimensional data is to project the data to 2 or 3 dimensions for visualization. However, there are a variety of methods to achieve this result and once projected, it can be difficult to ascribe biological significance to the observed features. Additionally, when analyzing single-cell data, the relationship between cells can be obscured by technical confounders such as variable gene capture rates. Results: To aid in the analysis and interpretation of single-cell RNA-Seq data, we have developed FastProject, a software tool which analyzes a gene expression matrix and produces a dynamic output report in which two-dimensional projections of the data can be explored. Annotated gene sets (referred to as gene 'signatures') are incorporated so that features in the projections can be understood in relation to the biological processes they might represent. FastProject provides a novel method of scoring each cell against a gene signature so as to minimize the effect of missed transcripts as well as a method to rank signature-projection pairings so that meaningful associations can be quickly identified. Additionally, FastProject is written with a modular architecture and designed to serve as a platform for incorporating and comparing new projection methods and gene selection algorithms. Conclusions: Here we present FastProject, a software package for two-dimensional visualization of single cell data, which utilizes a plethora of projection methods and provides a way to systematically investigate the biological relevance of these low dimensional representations by incorporating domain knowledge.

Systematic measurement biases make data normalization an essential preprocessing step in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. There may be multiple, competing considerations behind the assessment of normalization performance, some of them study-specific. Because normalization can have a large impact on downstream results (e.g., clustering and differential expression), it is critically important that practitioners assess the performance of competing methods. We have developed scone - a flexible framework for assessing normalization performance based on a comprehensive panel of data-driven metrics. Through graphical summaries and quantitative reports, scone summarizes performance trade-offs and ranks large numbers of normalization methods by aggregate panel performance. The method is implemented in the open-source Bioconductor R software package scone. We demonstrate the effectiveness of scone on a collection of scRNA-seq datasets, generated with different protocols, including Fluidigm C1 and 10x platforms. We show that top-performing normalization methods lead to better agreement with independent validation data.

We present VISION, a tool for annotating the sources of variation in single cell RNA-seq data in an automated, unbiased and scalable manner. VISION operates directly on the manifold of cell-cell similarity and employs a flexible annotation approach that can operate either with or without preconceived stratification of the cells into groups or along a continuum. We demonstrate the utility of VISION using a relatively homogeneous set of B cells from a cohort of lupus patients and healthy controls and show that it can derive important sources of cellular variation and link them to clinical phenotypes in a stratification free manner. VISION produces an interactive, low latency and feature rich web-based report that can be easily shared amongst researchers.

ABSTRACT Glucose metabolism is a critical regulator of T cell function, largely thought to support their activation and effector differentiation. Here, we investigate the relevance of individual glycolytic reactions in determining the pathogenicity of T helper 17 (Th17) cells using single-cell RNA-seq and Compass, an algorithm we previously developed for estimating metabolic flux from single-cell transcriptomes. Surprisingly, Compass predicted that the metabolic shunt between 3-phosphoglycerate (3PG) and 2-phosphoglycerate (2PG) is inversely correlated with pathogenicity in these cells, whereas both its upstream and downstream reactions were positively correlated. Perturbation of phosphoglycerate mutase (PGAM), an enzyme required for 3PG to 2PG conversion, resulted in an increase in protein expression of IL2, IL17, and TNFa, as well as induction of a pathogenic gene expression program. Consistent with PGAM playing a pro-regulatory role, inhibiting PGAM in Th17 cells resulted in exacerbated autoimmune responses in the adoptive transfer model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Finally, we further investigated the effects of modulating glucose concentration on Th17 cells in culture. Th17 cells differentiated under high- and low-glucose conditions substantially differed in their metabolic and effector transcriptomic programs, both central to Th17 function. Importantly, the PGAM-dependent gene module marks the least pathogenic state of Th17 cells irrespective of glucose concentration. Overall, our study identifies PGAM, contrary to other glycolytic enzymes, as a negative regulator of Th17 pathogenicity.