The identification of ultraconserved noncoding sequences in vertebrates has been associated with developmental regulators and DNA-binding proteins. One of the first of these was identified in the intergenic region between the Dlx-5 and Dlx-6 genes, members of the Dlx/ dll homeodomain-containing protein family. In previous experiments, we showed that Sonic hedgehog treatment of forebrain neural explants results in the activation of Dlx-2 and the novel noncoding RNA (ncRNA), Evf-1 . In this report, we show that the Dlx-5/6 ultraconserved region is transcribed to generate an alternatively spliced form of Evf-1, the ncRNA Evf-2 . Evf-2 specifically cooperates with Dlx-2 to increase the transcriptional activity of the Dlx-5/6 enhancer in a target and homeodomain-specific manner. A stable complex containing the Evf-2 ncRNA and the Dlx-2 protein forms in vivo, suggesting that the Evf-2 ncRNA activates transcriptional activity by directly influencing Dlx-2 activity. These experiments identify a novel mechanism whereby transcription is controlled by the cooperative actions of an ncRNA and a homeodomain protein. The possibility that a subset of vertebrate ultraconserved regions may function at both the DNA and RNA level to control key developmental regulators may explain why ultraconserved sequences exhibit 90% or more conservation even after 450 million years of vertebrate evolution.

Precise temporal control of gene expression in neuronal progenitors is necessary for correct regulation of neurogenesis and cell fate specification. However, the cellular heterogeneity of the developing CNS has posed a major obstacle to identifying the gene regulatory networks that control these processes. To address this, we used single-cell RNA sequencing to profile ten developmental stages encompassing the full course of retinal neurogenesis. This allowed us to comprehensively characterize changes in gene expression that occur during initiation of neurogenesis, changes in developmental competence, and specification and differentiation of each major retinal cell type. We identify the NFI transcription factors (Nfia, Nfib, and Nfix) as selectively expressed in late retinal progenitor cells and show that they control bipolar interneuron and Müller glia cell fate specification and promote proliferative quiescence.

Abstract Retinal ganglion cells (RGCs), which relay visual information from the eye to the brain, are the first cell type generated during retinal neurogenesis. Loss of function of the transcription factor Atoh7 , which is expressed in multipotent early neurogenic retinal progenitor cells, leads to a selective and near complete loss of RGCs. Atoh7 has thus been considered essential for conferring competence on progenitors to generate RGCs. However, when apoptosis is inhibited in Atoh7- deficient mice by loss of function of Bax , only a modest reduction in RGC number is observed. Single-cell RNA-Seq of Atoh7;Bax -deficient retinas shows that RGC differentiation is delayed, but that RGC precursors are grossly normal. Atoh7;Bax -deficient RGCs eventually mature, fire action potentials, and incorporate into retinal circuitry, but exhibit severe axonal guidance defects. This study reveals an essential role for Atoh7 in RGC survival, and demonstrates Atoh7- independent mechanisms for RGC specification.

Abstract Gene regulatory networks (GRNs), consisting of transcription factors and their target cis- regulatory sequences, control neurogenesis and cell fate specification in the developing central nervous system, but their organization is poorly characterized. In this study, we performed integrated single-cell RNA- and scATAC-seq analysis in both mouse and human retina to profile dynamic changes in gene expression, chromatin accessibility and transcription factor footprinting during retinal neurogenesis. We identified multiple interconnected, evolutionarily-conserved GRNs consisting of cell type-specific transcription factors that both activate expression of genes within their own network and often inhibit expression of genes in other networks. These GRNs control state transitions within primary retinal progenitors that underlie temporal patterning, regulate the transition from primary to neurogenic progenitors, and drive specification of each major retinal cell type. We confirmed the prediction of this analysis that the NFI transcription factors Nfia , Nfib , and Nfix selectively activate expression of genes that promote late-stage temporal identity in primary retinal progenitors. We also used GRNs to identify additional transcription factors that promote ( Insm1/2 ) and inhibit ( Tbx3 , Tcf7l1 / 2 ) rod photoreceptor specification in postnatal retina. This study provides an inventory of cis- and trans-acting factors that control retinal development, identifies transcription factors that control the temporal identity of retinal progenitors and cell fate specification, and will potentially guide cell-based therapies aimed at replacing retinal neurons lost due to disease.

Abstract A key component to overcoming the reproducibility crisis in biomedical research is the development of readily available, rigorously validated and renewable protein affinity reagents. As part of the NIH Protein Capture Reagents Program (PCRP), we have generated a collection of 1406 highly validated, immunoprecipitation (IP) and/or immunoblotting (IB) grade, mouse monoclonal antibodies (mAbs) to 736 human transcription factors. We used HuProt™ human protein microarrays to identify mAbs that recognize their cognate targets with exceptional specificity. Using an integrated production and validation pipeline, we validated these mAbs in multiple experimental applications, and have distributed them to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) and several commercial suppliers. This study allowed us to perform a meta-analysis that identified critical variables that contribute to the generation of high quality mAbs. We find that using full-length antigens for immunization, in combination with HuProt™ analysis, provides the highest overall success rates. The efficiencies built into this pipeline ensure substantial cost savings compared to current standard practices.

Precise temporal control of gene expression in neuronal progenitors is necessary for correct regulation of neurogenesis and cell fate specification. However, the extensive cellular heterogeneity of the developing CNS has posed a major obstacle to identifying the gene regulatory networks that control these processes. To address this, we used single cell RNA-sequencing to profile ten developmental stages encompassing the full course of retinal neurogenesis. This allowed us to comprehensively characterize changes in gene expression that occur during initiation of neurogenesis, changes in developmental competence, and specification and differentiation of each of the major retinal cell types. These data identify transitions in gene expression between early and late-stage retinal progenitors, as well as a classification of neurogenic progenitors. We identify here the NFI family of transcription factors (Nfia, Nfib, and Nfix) as genes with enriched expression within late RPCs, and show they are regulators of bipolar interneuron and Muller glia specification and the control of proliferative quiescence.

Public archives of next-generation sequencing data are growing exponentially, but the difficulty of marshaling this data has led to its underutilization by scientists. Here we present ASCOT, a resource that allows researchers to summarize, visualize, and query alternative splicing patterns in public RNA-Seq data. ASCOT enables rapid identification of splice-variants across tens of thousands of bulk and single cell RNA-Seq datasets in human and mouse. To demonstrate the utility of ASCOT, we first focused on the nervous system and identified many alternative exons used only by a single neuronal subtype. We then leveraged datasets from the ENCODE and GTEx consortiums to study the unique splicing patterns of rod photoreceptors and found that PTBP1 knockdown combined with overexpression of MSI1 and PCBP2 activates rod-specific exons in HepG2 liver cancer cells. Furthermore, we observed that MSI1 targets intronic UAG motifs proximal to the 5′ splice site and interacts synergistically with PTBP1 downregulation. Finally, we show that knockdown of MSI1 in the retina abolishes rod-specific splicing. This work demonstrates how large-scale analysis of public RNA-Seq datasets can yield key insights into cell type-specific control of RNA splicing and underscores the importance of considering both annotated and unannotated splicing events. ASCOT splicing and gene expression data tables, software, and interactive browser are available at http://ascot.cs.jhu.edu.

Retinal degenerative diseases including age-related macular degeneration and glaucoma are estimated to currently affect more than 14 million people in the United States, with an increased prevalence of retinal degenerations in aged individuals. An expanding aged population who are living longer forecasts an increased prevalence and economic burden of visual impairments. Improvements to visual health and treatment paradigms for progressive retinal degenerations slow vision loss. However, current treatments fail to remedy the root cause of visual impairments caused by retinal degenerations-loss of retinal neurons. Stimulation of retinal regeneration from endogenous cellular sources presents an exciting treatment avenue for replacement of lost retinal cells. In multiple species including zebrafish and Xenopus, Müller glial cells maintain a highly efficient regenerative ability to reconstitute lost cells throughout the organism's lifespan, highlighting potential therapeutic avenues for stimulation of retinal regeneration in humans. Here, we describe how the application of single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) has enhanced our understanding of Müller glial cell-derived retinal regeneration, including the characterization of gene regulatory networks that facilitate/inhibit regenerative responses. Additionally, we provide a validated experimental framework for cellular preparation of mouse retinal cells as input into scRNA-seq experiments, including insights into experimental design and analyses of resulting data.

Abstract During mouse embryonic brain development, the Evf2 ultraconserved enhancer (UCE) lncRNA guides the Dlx5/6UCE to ∼129 sites across chr6. However, previous work identified only 4 transcriptionally regulated targets associated with Evf2 -Dlx5/6UCE enhancer-gene guided sites (EGGs), raising questions about the significance of the majority of Evf2 -EGGs. Here, single cell transcriptomics (scRNAseq) shows that Evf2 -EGGs on chr6 coincide with subpopulation-specific Evf2 transcriptional targets, revealing far greater alignment between EGGs and transcriptional targets than previously reported. Surprisingly, subpopulation-specific Evf2 regulated gene networks in embryonic progenitors predict adult synaptic and seizure defects. Evf2 regulation of EGGs to gene bodies (GB, Dlx5/6UCE locations within ±5kb of the target gene) divides chr6 into short-range (<10Mb distant), highly activated genes, and long/super-long-range (10-129Mb), moderately repressed genes. Clustering of Evf2 transcriptionally regulated chr6 targets in populations where Evf2 is first activated supports that Evf2 -EGG transcriptional effects can occur from EGG shifts as far as 3Mb, uncoupling enhancer shift distance and transcriptional direction from transcriptional outcome. Evf2 RNA binding sites (RBSs) divide chr6 into 4 major regions, consistent with a role for RBS chromosomal spacing in long-and super-long-range EGG selectivity. Surprisingly, 95% of 147 RBSs genome-wide potentially form inter-chromosomal DNA loops. Evf2 -regulated combinatorial recruitment of Evf2 -ribonucleoproteins at EGGs and RBSs, together with effects on homeodomain transcription factor DNA motif recognition, support a novel model of lncRNA directed multi-modal EGG selectivity during intra- and inter-chromosomal gene regulation.

Age-related vision loss caused by retinal neurodegenerative pathologies is becoming more prevalent in our ageing society. To understand the physiological and molecular impact of ageing on retinal homeostasis, we used the short-lived African turquoise killifish, a model known to naturally develop central nervous system (CNS) ageing hallmarks and vision loss. Bulk and single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of three age groups (6-, 12-, and 18-week-old) identified transcriptional ageing fingerprints in the killifish retina, unveiling pathways also identified in the aged brain, including oxidative stress, gliosis, and inflammageing. These findings were comparable to observations in ageing mouse retina. Additionally, transcriptional changes in genes related to retinal diseases, such as glaucoma and age-related macular degeneration, were observed. The cellular heterogeneity in the killifish retina was characterised, confirming the presence of all typical vertebrate retinal cell types. Data integration from age-matched samples between the bulk and scRNA-seq experiments revealed a loss of cellular specificity in gene expression upon ageing, suggesting potential disruption in transcriptional homeostasis. Differential expression analysis within the identified cell types highlighted the role of glial/immune cells as important stress regulators during ageing. Our work emphasises the value of the fast-ageing killifish in elucidating molecular signatures in age-associated retinal disease and vision decline. This study contributes to the understanding of how age-related changes in molecular pathways may impact CNS health, providing insights that may inform future therapeutic strategies for age-related pathologies.