Abstract Recent developments in stem cell biology have enabled the study of cell fate decisions in early human development that are impossible to study in vivo. However, understanding how development varies across individuals and, in particular, the influence of common genetic variants during this process has not been characterised. Here, we exploit human iPS cell lines from 125 donors, a pooled experimental design, and single-cell RNA-sequencing to study population variation of endoderm differentiation. We identify molecular markers that are predictive of differentiation efficiency of individual lines, and utilise heterogeneity in the genetic background across individuals to map hundreds of expression quantitative trait loci that influence expression dynamically during differentiation and across cellular contexts.

Abstract Common genetic variants can have profound effects on cellular function, but studying these effects in primary human tissue samples and during development is challenging. Human induced pluripotent stem cell (iPSC) technology holds great promise for assessing these effects across different differentiation contexts. Here, we use an efficient pooling strategy to differentiate 215 iPS cell lines towards a midbrain neural fate, including dopaminergic neurons, and profile over 1 million cells sampled across three differentiation timepoints using single cell RNA sequencing. We find that the proportion of neuronal cells produced by each cell line is highly reproducible over different experimental batches, and identify robust molecular markers in pluripotent cells that predict line-to-line differences in cell fate. We identify expression quantitative trait loci (eQTL) that manifest at different stages of neuronal development, and in response to oxidative stress, by exposing cells to rotenone. We find over one thousand eQTL that colocalise with a known risk locus for a neurological trait, nearly half of which are not found in GTEx. Our study illustrates how coupling single cell transcriptomics with long-term iPSC differentiation can profile mechanistic effects of human trait-associated genetic variants in otherwise inaccessible cell states.

Predicting a multicellular organism's phenotype quantitatively from its genotype is challenging, as genetic effects must propagate up time and length scales. Circadian clocks are intracellular regulators that control temporal gene expression patterns and hence metabolism, physiology and behaviour, from sleep/wake cycles in mammals to flowering in plants1-3. Clock genes are rarely essential but appropriate alleles can confer a competitive advantage4,5 and have been repeatedly selected during crop domestication3,6. Here we quantitatively explain and predict canonical phenotypes of circadian timing in a multicellular, model organism. We used metabolic and physiological data to combine and extend mathematical models of rhythmic gene expression, photoperiod-dependent flowering, elongation growth and starch metabolism within a Framework Model for growth of Arabidopsis thaliana7-9. The model predicted the effect of altered circadian timing upon each particular phenotype in clock-mutant plants. Altered night-time metabolism of stored starch accounted for most but not all of the decrease in whole-plant growth rate. Altered mobilisation of a secondary store of organic acids quantitatively explained the remaining defect. Our results link genotype through specific processes to higher-level phenotypes, formalising our understanding of a subtle, pleiotropic syndrome at the whole-organism level, and validating the systems approach to understand complex traits starting from intracellular circuits.

Daily light-dark cycles (LD) drive dynamic regulation of plant and algal transcriptomes via photoreceptor pathways and 24-hour, circadian rhythms. Diel regulation of protein levels and modifications has been less studied. Ostreococcus tauri, the smallest free-living eukaryote, provides a minimal model proteome for the green lineage. Here, we compare transcriptome data under LD to the algal proteome and phosphoproteome, assayed using shotgun mass-spectrometry. Under 10% of 855 quantified proteins were rhythmic but two-thirds of 860 phosphoproteins showed rhythmic modification(s). Most rhythmic proteins peaked in the daytime. Model simulations showed that light-stimulated protein synthesis largely accounts for this distribution of protein peaks. Prompted by dark-stable proteins, we sampled during prolonged dark adaptation, where stable RNAs and very limited change to the proteome suggested a quiescent, cellular "dark state". In LD, acid-directed protein phosphorylation sites were enriched in antiphase to proline-directed sites. Strikingly, 39% of rhythmic phospho-sites reached peak levels just before dawn. This anticipatory phosphorylation is distinct from light-responsive translation but consistent with plant phosphoprotein profiles, suggesting that a clock-regulated phospho-dawn prepares green cells for daytime functions.

Integrated analysis using proteomics, RNAseq and polysome profiles revealed a major impact on the proteome caused by erosion of X chromosome inactivation (XCI) in human iPSCs. Low XIST RNA levels were detected in ~40% of iPSC lines from healthy female donors and strongly correlated with erosion of XCI, as evaluated by biallelic expression. Low XIST levels correlated with increased RNA and protein expression from X-linked genes, a ~13% increase in total cell protein content, and significantly increased levels of polysomes, ribosomes and translation factors. Low XIST lines also showed increased protein expression for many autosomal genes, but without a corresponding mRNA increase, producing a major difference in the protein-RNA correlation between genes on either the X chromosome, or autosomes. We conclude that erosion of XCI causes a major remodelling of the proteome, with posttranscriptional mechanisms affecting the expression of a much wider range of proteins and disease-linked gene loci than previously realised.

Recent developments in stem cell biology have enabled the study of cell fate decisions in early human development that are impossible to study in vivo. However, understanding how development varies across individuals and, in particular, the influence of common genetic variants during this process has not been characterised. Here, we exploit human iPS cell lines from 125 donors, a pooled experimental design, and single-cell RNA-sequencing to study population variation of endoderm differentiation. We identify molecular markers that are predictive of differentiation efficiency, and utilise heterogeneity in the genetic background across individuals to map hundreds of expression quantitative trait loci that influence expression dynamically during differentiation and across cellular contexts.

Identifying regulatory genetic effects in pluripotent cells provides important insights into disease variants with potentially transient or developmental origins. Combining existing and newly-generated data, we characterized 1,367 iPSC lines from 948 unique donors, collectively analyzed within the “Integrated iPSC QTL” (i2QTL) Consortium. The sample size of our study allowed us to derive the most comprehensive map of quantitative trait loci (QTL) in pluripotent human cells to date. We mapped the effects of nearby common genetic variants on five expression phenotypes, identifying cis -QTL at gene-, exon-level and transcript-, splicing-, alternative polyadenylation-ratio (APA) for a total of 18,556 genes. For gene-level, we further quantified the effects of rare and singleton variants, and the effect of distal variants that act in trans ( trans -eQTL), which we replicated in independent samples. Our data are a valuable community resource, uncovering novel regulatory effects that have not previously been described in differentiated cells and tissues. Building on this regulatory map, we functionally explore GWAS signals for over 4,336 trait loci, finding evidence for colocalization with common and rare iPSC QTL for traits such as height and BMI, and diseases, such as cancer and coronary artery disease.

Plants respond to seasonal cues, such as the photoperiod, to adapt to current conditions and to prepare for environmental changes in the season to come. To assess photoperiodic responses at the protein level, we quantified the proteome of the model plant Arabidopsis thaliana by mass spectrometry across four photoperiods. This revealed coordinated changes of abundance in proteins of photosynthesis, primary and secondary metabolism, including pigment biosynthesis, consistent with higher metabolic activity in long photoperiods. Higher translation rates in the daytime than the night likely contribute to these changes via rhythmic changes in RNA abundance. Photoperiodic control of protein levels might be greatest only if high translation rates coincide with high transcript levels in some photoperiods. We term this proposed mechanism 'translational coincidence', mathematically model its components, and demonstrate its effect on the Arabidopsis proteome. Datasets from a green alga and a cyanobacterium suggest that translational coincidence contributes to seasonal control of the proteome in many phototrophic organisms. This may explain why many transcripts but not their cognate proteins exhibit diurnal rhythms.

We assessed temperature influence on flowering by incorporating temperature-responsive flowering mechanisms across developmental age into an existing model. Temperature influences both the leaf production rate and expression of FLOWERING LOCUS T (FT), a photoperiodic flowering regulator, in leaves. The Arabidopsis Framework Model incorporated temperature influence on leaf growth but ignored the consequences of leaf growth on and direct temperature influence of FT expression. We measured FT production in differently aged leaves and modified the model, adding the mechanistic temperature influence on FT transcription, and linking FT to leaf growth. Our simulations suggest that in long days, the developmental timing (leaf number) at which the reproductive transition occurs is influenced by day length and temperature through FT, while temperature influences the rate of leaf production and the time (in days) the transition occurs. Further, we demonstrated that FT is mainly produced in the first 10 leaves in the Columbia ecotype, and that FT accumulation alone cannot explain flowering in conditions in which flowering is delayed. Our simulations supported our hypotheses that: 1) temperature regulation of FT, accumulated with leaf growth, is a component of thermal time, and 2) incorporating mechanistic temperature regulation of FT can improve model predictions in fluctuating temperatures.

In plants, light receptors play a pivotal role in photoperiod sensing, enabling them to track seasonal progression. Photoperiod sensing arises from an interaction between the plant's endogenous circadian oscillator and external light cues. Here, we characterise the role of phytochrome A (phyA) in photoperiod sensing. Our meta-analysis of functional genomic datasets identified phyA as a principal transcriptional regulator of morning-activated genes, specifically in short photoperiods. We demonstrate that PHYA expression is under the direct control of the PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR transcription factors, PIF4 and PIF5. As a result, phyA protein accumulates during the night, especially in short photoperiods. At dawn phyA activation by light results in a burst of gene expression, with consequences for anthocyanin accumulation. The combination of complex regulation of PHYA transcript and the unique molecular properties of phyA protein make this pathway a sensitive detector of both dawn and photoperiod.