The increasing demand for cryo-electron microscopy (cryo-EM) reveals drawbacks in current sample preparation protocols, such as sample waste and lack of reproducibility. Here, we present several technical developments that provide controlled and efficient sample preparation for cryo-EM studies. Pin printing substantially reduces sample waste by depositing only a sub-nanoliter volume of sample on the carrier surface. Sample evaporation is mitigated by dewpoint control feedback loops. The deposited sample is vitrified by jets of cryogen followed by submersion into a cryogen bath. Because the cryogen jets cool the sample from the center, premounted autogrids can be used and loaded directly into automated cryo-EMs. We integrated these steps into a single device, named VitroJet. The device's performance was validated by resolving 4 standard proteins (apoferritin, GroEL, worm hemoglobin, beta-galactosidase) to ~3 Å resolution using a 200-kV electron microscope. The VitroJet offers a promising solution for improved automated sample preparation in cryo-EM studies.

In cryo-electron microscopy structure determination, embedding biomolecules in vitreous ice of optimal thickness is critical. Ice thickness assessment and selection of suitable holes for data collection are currently part of time-consuming preparatory routines performed on expensive electron microscopes. For this reason, we developed a method to determine ice thickness during sample preparation using the optical camera integrated in the VitroJet. As a result, the ice thickness of buffer-suspended holes on an EM grid can be determined faithfully in the working range relevant for single particle cryo-EM. Dependent on the thickness, the error is below +- 20 nm in the range between 0 - 70 nm down to +- 10 nm in the thinnest ice regions (10 - 40 nm). Single particle structures of apoferritin were determined at two distinct thicknesses of 30 nm and 70 nm to demonstrate the suitability of optical layer thickness measurements for time-efficient cryo-EM structure determination.