Summary Despite the intimate link between cell organization and function, the principles underlying intracellular organization and the relation between organization, gene expression and phenotype are not well understood. We address this by creating a benchmark for mean cell organization and the natural range of cell-to-cell variation. This benchmark can be used for comparison to other normal or abnormal cell states. To do this, we developed a reproducible microscope imaging pipeline to generate a high-quality dataset of 3D, high-resolution images of over 200,000 live cells from 25 isogenic human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines from the Allen Cell Collection. Each line contains one fluorescently tagged protein, created via endogenous CRISPR/Cas9 gene editing, representing a key cellular structure or organelle. We used these images to develop a new multi-part and generalizable analysis approach of the locations, amounts, and variation of these 25 cellular structures. Taking an integrated approach, we found that both the extent to which a structure’s individual location varied (“stereotypy”) and the extent to which the structure localized relative to all the other cellular structures (“concordance”) were robust to a wide range of cell shape variation, from flatter to taller, smaller to larger, or less to more polarized cells. We also found that these cellular structures varied greatly in how their volumes scaled with cell and nuclear size. These analyses create a data-driven set of quantitative rules for the locations, amounts, and variation of 25 cellular structures within the hiPSC as a normal baseline for cell organization.

WNT10B belongs to the family of WNT proteins that are implicated in a range of phenomena that are affected by the Wnt signaling pathway. Recent studies have shown that WNT10B plays a role in colorectal cancer. WNTs have been found to directly affect the stemness of the tumor cells via regulation of ASCL2. Switching off the ASCL2 literally blocks the stemness process of the tumor cells and vice versa. Furthermore, recent findings suggest BVES to be highly suppressed in malignancies and in vitro deletions of BVES show higher Wnt signaling activity to induce stemness. WNT10B was found to be highly expressed in such cases. Often, in biology, we are faced with the problem of exploring relevant unknown biological hypotheses in the form of myriads of combination of factors that might be affecting the pathway under certain conditions. For example, WNT10B-ASCL2 is one such 2nd order combination whose relation needs to be tested under the influence of recently developed porcupine-WNT inhibitor ETC-1922159. The inhibitor is known to suppress PORCN (porcupine) and thus inhibit a range of oncogenes known to be directly or indirectly affected by the Wnts. In a recent unpublished work in bioRxiv, we had the opportunity to rank these unknown biological hypotheses for down regulated genes at 2nd order level after the drug was administered. The in silico observations showed that the combination of WNT10B-ASCL2 was assigned a relatively lower rank, thus validating the pipeline's efficacy with the confirmed wet lab experiment that indicate that both WNT10B and ASCL2 were down regulated after treatment in cancer cells. Here, we take one step further by in silico analysis of the 3rd order combinations of WNT10B-X-X (X can be known or unknown factor), from a range of 100 randomly picked down regulated genes after ETC-1922159 treatment. The pipeline uses the density based HSIC (Hilbert Schmidt Information Criterion) sensitivity index with an rbf (radial basis function) kernel, which is known to be highly effective in sensitivity analysis. Various unknown/unexplored/untested 3rd order biological hypotheses emerge some of which are confirmed in wet lab, while others need to be tested. The potential of such ranking is indispensable in the current era of search in a vast combinatorial forest.

To investigate the fundamental question of how cellular variations arise across spatiotemporal scales in a population of identical healthy cells, we focused on nuclear growth in hiPS cell colonies as a model system. We generated a 3D timelapse dataset of thousands of nuclei over multiple days, and developed open-source tools for image and data analysis and an interactive timelapse viewer for exploring quantitative features of nuclear size and shape. We performed a data-driven analysis of nuclear growth variations across timescales. We found that individual nuclear volume growth trajectories arise from short timescale variations attributable to their spatiotemporal context within the colony. We identified a strikingly time-invariant volume compensation relationship between nuclear growth duration and starting volume across the population. Notably, we discovered that inheritance plays a crucial role in determining these two key nuclear growth features while other growth features are determined by their spatiotemporal context and are not inherited.

Abstract A key challenge in understanding subcellular organization is quantifying interpretable measurements of intracellular structures with complex multi-piece morphologies in an objective, robust and generalizable manner. Here we introduce a morphology-appropriate representation learning framework that uses 3D rotation invariant autoencoders and point clouds. This framework is used to learn representations of complex multi-piece morphologies that are independent of orientation, compact, and easy to interpret. We apply our framework to intracellular structures with punctate morphologies (e.g. DNA replication foci) and polymorphic morphologies (e.g. nucleoli). We systematically compare our framework to image-based autoencoders across several intracellular structure datasets, including a synthetic dataset with pre-defined rules of organization. We explore the trade-offs in the performance of different models by performing multi-metric benchmarking across efficiency, generative capability, and representation expressivity metrics. We find that our framework, which embraces the underlying morphology of multi-piece structures, facilitates the unsupervised discovery of sub-clusters for each structure. We show how our approach can also be applied to phenotypic profiling using a dataset of nucleolar images following drug perturbations. We implement and provide all representation learning models using CytoDL, a python package for flexible and configurable deep learning experiments.