Abstract The recognition that individual GPCRs can activate multiple signaling pathways has raised the possibility of developing drugs selectively targeting therapeutically relevant ones. This requires tools to determine which G proteins and βarrestins are activated by a given receptor. Here, we present a set of BRET sensors monitoring the activation of the 12 G protein subtypes based on the translocation of their effectors to the plasma membrane (EMTA). Unlike most of the existing detection systems, EMTA does not require modification of receptors or G proteins (except for G s ). EMTA was found to be suitable for the detection of constitutive activity, inverse agonism, biased signaling and polypharmacology. Profiling of 100 therapeutically relevant human GPCRs resulted in 1,500 pathway-specific concentration-response curves and revealed a great diversity of coupling profiles ranging from exquisite selectivity to broad promiscuity. Overall, this work describes unique resources for studying the complexities underlying GPCR signaling and pharmacology.

Abstract Cannabinoid CB1 and CB2 receptors are members of the G protein-coupled receptor family, which is the largest class of membrane proteins in the human genome. As part of the endocannabinoid system, they have many regulatory functions in the human body. Their malfunction therefore triggers a diverse set of undesired conditions, such as pain, neuropathy, nephropathy, pruritus, osteoporosis, cachexia and Alzheimer’s disease. Although drugs targeting the system exist, the molecular and functional mechanisms involved are still poorly understood, preventing the development of better therapeutics with fewer undesired effects. One path toward the development of better and safer medicines targeting cannabinoid receptors relies on the ability of some compounds to activate a subset of pathways engaged by the receptor while sparing or even inhibiting the others, a phenomenon known as biased signaling. To take advantage of this phenomenon for drug development, a better profiling of the pathways engaged by the receptors is required. Using a BRET-based signaling detection platform, we systematically analyzed the primary signaling cascades activated by CB1 and CB2 receptors, including 9 G protein and 2 β-arrestin subtypes. Given that biased signaling is driven by ligand-specific distinct active conformations of the receptor, establishing a link between the signaling profiles elicited by different drugs and their chemotypes may help designing compounds that selectively activate beneficial pathways while avoiding those leading to undesired effects. We screened a selection of 35 structurally diverse ligands, including endocannabinoids, phytocannabinoids and synthetic compounds structurally similar or significantly different from natural cannabinoids. Our data show that biased signaling is a prominent feature of the cannabinoid receptor system and that, as predicted, ligands with different chemotypes have distinct signaling profiles. The study therefore allows for better understanding of cannabinoid receptors signaling and provides the information about tool compounds that can now be used to link signaling pathways to biological outcomes, aiding the design of improved therapeutics.

Abstract Formyl peptide receptor 2 (FPR2), a member of the family of G protein-coupled receptors (GPCRs), mediates neutrophil migration, a response that has been linked to β-arrestin recruitment. β-Arrestin regulates GPCR endocytosis and can also elicit non-canonical receptor signaling. To determine the poorly understood role of β-arrestin in FPR2 endocytosis and in NADPH-oxidase activation in neutrophils, Barbadin was used as a research tool in this study. Barbadin has been shown to bind the clathrin adaptor protein (AP2) and thereby prevent β- arrestin/AP2 interaction and β-arrestin-mediated GPCR endocytosis. In agreement with this, AP2/β-arrestin interaction induced by an FPR2-specific agonist was inhibited by Barbadin. Unexpectedly, however, Barbadin did not inhibit FPR2 endocytosis, indicating that a mechanism independent of β-arrestin/AP2 interaction may sustain FPR2 endocytosis. This was confirmed by the fact, that FPR2 also underwent agonist-promoted endocytosis in β-arrestin deficient cells, albeit at a diminished level as compared to wild type cells. Dissection of the Barbadin effects on FPR2-mediated neutrophil functions including NADPH-oxidase activation mediated release of reactive oxygen species (ROS) and chemotaxis reveled that Barbadin had no effect on chemotactic migration whereas the release of ROS was potentiated/primed. The effect of Barbadin on ROS production was reversible, independent of β-arrestin recruitment, and similar to that induced by latrunculin A. Taken together, our data demonstrate that endocytic uptake of FPR2 occurs independently of β-arrestin, while Barbadin selectively augments FPR2-mediated neutrophil ROS production independently of receptor endocytosis. Given that Barbadin binds to AP2 and prevents the AP2/β-arrestin interaction, our results indicate a role for AP2 in FPR2-mediated ROS release from human neutrophils.

G protein-coupled receptors (GPCRs) drive an array of important physiological functions and are the targets of nearly one-third of all FDA approved drugs. Large scale genomic initiatives are mapping the genetic diversity in GPCRs, however, a map of which GPCR genetic variants are associated with phenotypic variation and disease is lacking. Furthermore, the mechanistic basis of how the individual GPCR genetic variants regulate molecular function is also largely unknown. We performed a phenome-wide association analysis for 269 common protein-altering variants in 156 GPCRs and 275 phenotypes using data from 337,205 unrelated white British UK Biobank participants and identified 138 associations at a false discovery rate of 5%. We found a novel association between rs12295710 in MRGPRE , a member of the Mas-related receptor family involved in nociception, and migraine risk. We also identified an association between rs3732378, a missense mutation in the binding pocket of CX3CR1, and hypothyroidism. Five orphan GPCRs had eight genetic associations, highlighting novel biology for these receptors of unknown function. We found several associations between GPCR variants and food intake phenotypes, including an association between the variants in TAS2R38 known to affect the ability to taste phenylthiocarbamide and tea intake as well as a non-additive associations between variants in TAS2R19 and TAS2R31 and coffee and tea intake. Finally, we tested whether genetic variants in ADRB2 associated with immune cell amounts and pulmonary function affect downstream signaling pathways and found that two ADRB2 haplotypes are associated with differential signaling relative to the most common haplotype. Overall, this study provides a map of genetic associations for GPCR coding variants across a wide variety of phenotypes that can inform future drug discovery efforts targeting GPCRs.

Malaria causes millions of deaths worldwide and is considered a huge public health problem for underdeveloped countries. The most severe cases of malaria present complications of the host circulatory system, which may cause clogging and rupture of blood vessels, leading to death or important sequelae. Because of the previously suggested role of thrombin and platelet aggregation in Plasmodium falciparum biology, we hypothesized that one of the GPCR-like proteins identified in the genome of the parasite, P. falciparum serpentine receptor 12 (PfSR12), could be a thrombin-activated GPCR. To test this hypothesis we used a series of Bioluminescence and Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-based biosensors to investigate the signaling activity of PfSR12. Using an Obelin based biosensor, thrombin promoted a PfSR12-dependent cytosolic Ca2+ rise in HEK293 cells. This Ca2+ mobilization was accompanied by DAG formation and PKC activation as detected using DAG and PKC BRET-based biosensors indicating a Gq/PLC/IP3 signaling pathway. The role of Gq was confirm using Gq/11 knockout HEK293 cells as well as the Gq-selective inhibitor, YM254890. Further investigation revealed that PfSR12 is not itself a thrombin receptor but rather promotes the increase of cell surface expression of an endogenous thrombin receptor. This chaperone-like effect was not selective for thrombin receptors as PfSR12 expression also promoted an increased muscarinic type 3 receptor (M3R)-promoted DAG and PKC responses. This increase response was accompanied by an increase in surface expression of M3R. Our data indicate that PfSR12 acts as a chaperone and increases the expression of several GPCRs resulting in increased responsiveness to various hormones of mammalian cells that could contribute to the deleterious effects of Plasmodium falciparum infection.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Interaction of β-arrestins (βarrs) upon agonist-stimulation is a hallmark of G protein-coupled receptors (GPCRs) resulting in receptor desensitization, endocytosis and signaling. Although overall functional roles of βarrs are typically believed to be conserved across different receptors, emerging data now clearly unveils receptor-specific functional contribution of βarrs. The underlying mechanism however remains mostly speculative and represents a key missing link in our current understanding of GPCR signaling and regulatory paradigms. Here, we develop synthetic intrabody-based conformational sensors that help us visualize the assembly and trafficking of GPCR-βarr1 complexes in cellular context for a broad set of receptors with spatio-temporal resolution. Surprisingly, these conformational sensors reveal a previously unappreciated level of diversity in GPCR-βarr complexes that extends beyond the current framework of affinity-based classification and phosphorylation-code-based interaction patterns. More importantly, this conformational diversity arising from spatial signature of phosphorylation sites manifests directly in the form of distinct functional outcomes, including even opposite contribution of βarrs in signal-transduction for different receptors. Taken together, these findings uncover that despite an overall similar interaction and trafficking patterns; critical structural and functional differences exist in βarr complexes for different GPCRs that define and fine-tune receptor-specific downstream responses.