Epigenetic dysregulation of gene expression is thought to be critically involved in the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD). Recent studies indicate that DNA methylation and DNA hydroxymethylation are 2 important epigenetic mechanisms that regulate gene expression in the aging brain. However, very little is known about the levels of markers of DNA methylation and hydroxymethylation in the brains of patients with AD, the cell-type specificity of putative AD-related alterations in these markers, as well as the link between epigenetic alterations and the gross pathology of AD. The present quantitative immunohistochemical study investigated the levels of the 2 most important markers of DNA methylation and hydroxymethylation, that is, 5-methylcytidine (5-mC) and 5-hydroxymethylcytidine (5-hmC), in the hippocampus of AD patients (n = 10) and compared these to non-demented, age-matched controls (n = 10). In addition, the levels of 5-hmC in the hippocampus of a pair of monozygotic twins discordant for AD were assessed. The levels of 5-mC and 5-hmC were furthermore analyzed in a cell-type and hippocampal subregion–specific manner, and were correlated with amyloid plaque load and neurofibrillary tangle load. The results showed robust decreases in the hippocampal levels of 5-mC and 5-hmC in AD patients (19.6% and 20.2%, respectively). Similar results were obtained for the twin with AD when compared to the non-demented co-twin. Moreover, levels of 5-mC as well as the levels of 5-hmC showed a significant negative correlation with amyloid plaque load in the hippocampus (rp = −0.539, p = 0.021 for 5-mC and rp = −0.558, p = 0.016 for 5-hmC). These human postmortem results thus strengthen the notion that AD is associated with alterations in DNA methylation and hydroxymethylation, and provide a basis for further epigenetic studies identifying the exact genetic loci with aberrant epigenetic signatures.

ABSTRACT Epigenome-wide association studies of Alzheimer’s disease have highlighted neuropathology-associated DNA methylation differences, although existing studies have been limited in sample size and utilized different brain regions. Here, we combine data from six DNA methylomic studies of Alzheimer’s disease (N=1,453 unique individuals) to identify differential methylation associated with Braak stage in different brain regions and across cortex. We identify 236 CpGs in the prefrontal cortex, 95 CpGs in the temporal gyrus and ten CpGs in the entorhinal cortex at Bonferroni significance, with none in the cerebellum. Our cross-cortex meta-analysis (N=1,408 donors) identifies 220 CpGs associated with neuropathology, annotated to 121 genes, of which 84 genes have not been previously reported at this significance threshold. We have replicated our findings using two further DNA methylomic datasets consisting of a further > 600 unique donors. The meta-analysis summary statistics are available in our online data resource ( www.epigenomicslab.com/ad-meta-analysis/ ).

Abstract Introduction In the progressive phase of multiple sclerosis (MS), the hampered differentiation capacity of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) eventually results in remyelination failure. We have previously shown that DNA methylation of Id2/Id4 is highly involved in OPC differentiation and remyelination. In this study, we took an unbiased approach by determining genome-wide DNA methylation patterns within chronically demyelinated MS lesions and investigated how certain epigenetic signatures relate to OPC differentiation capacity. Methods We compared genome-wide DNA methylation and transcriptional profiles between chronically demyelinated MS lesions and matched normal-appearing white matter (NAWM), making use of post-mortem brain tissue (n=9/group). DNA methylation differences that inversely correlated with mRNA expression of their corresponding genes were validated for their cell-type specificity in laser-captured OPCs using pyrosequencing. The CRISPR-dCas9-DNMT3a/TET1 system was used to epigenetically edit human-iPSC-derived oligodendrocytes to assess the effect on cellular differentiation. Results Our data show hypermethylation of CpGs within genes that cluster in gene ontologies related to myelination and axon ensheathment. Cell type-specific validation indicates a region-dependent hypermethylation of MBP , encoding for myelin basic protein, in OPCs obtained from white matter lesions compared to NAWM-derived OPCs. By altering the DNA methylation state of specific CpGs within the promotor region of MBP , using epigenetic editing, we show that cellular differentiation can be bidirectionally manipulated using the CRISPR-dCas9-DNMT3a/TET1 system in vitro . Conclusion Our data indicate that OPCs within chronically demyelinated MS lesions acquire an inhibitory phenotype, which translates into hypermethylation of crucial myelination related genes. Altering the epigenetic status of MBP can restore the differentiation capacity of OPCs and possibly boost (re)myelination.

Real-time reverse transcription PCR (qPCR) normalized to an internal reference gene (RG), is a frequently used method for quantifying gene expression changes in neuroscience. Although RG expression is assumed to be constantly independent of physiological or experimental conditions, several studies have shown that commonly used RGs are not expressed stably. The use of unstable RGs has a profound effect on the conclusions drawn from studies on gene expression, and almost universally results in spurious estimation of target gene expression. Approaches aimed at selecting and validating RGs often make use of different statistical methods, which may lead to conflicting results. The present study evaluates the expression of 5 candidate RGs ( Actb , Pgk1 , Sdha , Gapdh , Rnu6b ) as a function of hypoxia exposure and hypothermic treatment in the neonatal rat cerebral cortex -in order to identify RGs that are stably expressed under these experimental conditions- and compares several statistical approaches that have been proposed to validate RGs. In doing so, we first analyzed the RG ranking stability proposed by several widely used statistical methods and related tools, i.e. the Coefficient of Variation (CV) analysis, GeNorm, NormFinder, BestKeeper, and the ΔCt method. Subsequently, we compared RG expression patterns between the various experimental groups. We found that these statistical methods, next to producing different rankings per se, all ranked RGs displaying significant differences in expression levels between groups as the most stable RG. As a consequence, when assessing the impact of RG selection on target gene expression quantification , substantial differences in target gene expression profiles were observed. As such, by assessing mRNA expression profiles within the neonatal rat brain cortex in hypoxia and hypothermia as a showcase, this study underlines the importance of further validating RGs for each new experimental paradigm considering the limitations of each selection method.

Abstract Recent studies have demonstrated that the dorsal raphe nucleus (DRN) is among the first brain regions affected in Alzheimer’s disease. Hence, in this study we conducted the first comprehensive epigenetic analysis of the DRN in AD, targeting both bulk tissue and single isolated cells. The Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChip array was used to analyze the bulk tissue, assessing differentially modified positions (DMoPs) and regions (DMoRs) associated with Braak stage. The strongest Braak stage-associated DMoR in TNXB was targeted in a second patient cohort utilizing single laser-capture microdissected serotonin-positive (5-HT+) and -negative (5-HT-) cells isolated from the DRN. Our study revealed previously identified epigenetic loci, including TNXB and PGLYRP1 , and novel loci, including RBMXL2 , CAST , GNAT1 , MALAT1 , and DNAJB13 . Strikingly, we found that the methylation profile of TNXB depends both on disease phenotype and cell type analyzed, emphasizing the significance of single cell(-type) neuroepigenetic studies in AD.

Abstract Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease, resulting in an irreversible deterioration of multiple brain regions associated with cognitive dysfunction. Phosphorylation of the microtubule-associated protein, Tau, is known to occur decades before symptomatic AD. The Src family of tyrosine kinases are known to phosphorylate select tyrosine sites on Tau and promote microtubule disassembly and subsequent neurofibrillary tangle (NFT) formation. Our data show that the proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase Src colocalizes with a range of late (PHF1) to early (MC1) AD-associated phosphorylated Tau epitopes. The strongest co-occurrence is seen with MC1 (probability of MC1 given Src =100%), an early AD-specific conformational dependent epitope. Single-cell RNA sequencing data of 101 subjects show that Src is upregulated in both AD inhibitory and excitatory neurons. The most significantly affected, by orders of magnitude, were excitatory neurons which are the most prone to pathological Tau accumulation. We measured Src phosphorylation by mass spectrometry across a cohort of 48 patient neocortical tissues and found that Src has increased phosphorylation on Ser75, Tyr187, and Tyr440 in AD, showing that Src kinase undergoes distinct phosphorylation alterations in AD. Through Brownian dynamics simulations of Src and Tau, we show that as Tau undergoes the transition into disease-associated paired helical filaments, there is a notable seven-fold increase in Src contact with Tau. These results collectively emphasize Src kinase’s central role in Tau phosphorylation and its close association with Tau epitopes, presenting a promising target for potential therapeutic intervention.

Abstract Repetitive neonatal painful procedures experienced in the neonatal intensive care unit (NICU) are known to alter the development of the nociceptive system and have long-lasting consequences, notably lower post-operative µ-opioid receptor levels in the spinal cord. Given the influence of the NICU on the epigenome, the present study hypothesized that neonatal procedural pain alters the DNA methylation status of the opioid receptor mu 1 encoding gene ( Mor-1 ) in the spinal cord and dorsal root ganglions (DRGs). To this end, the needle prick model of repetitive neonatal pain was used, and methylation of Mor-1 promotor was assessed in the spinal cord and the DRG using bisulfite pyrosequencing. Our findings demonstrated that neonatal procedural pain increased spinal cord Mor-1 promotor DNA methylation in the ipsilateral side as compared to the contralateral side, an effect that was not observed in the control animals, nor in the DRG. We also identified a behaviorally-associated CpG site following neonatal needle pricks. This study is the first to highlight a localized and noxious-stimuli-dependent effect of repetitive neonatal procedural pain on Mor-1 promotor methylation and emphasizes the need to explore the effects of repetitive neonatal procedural pain on the epigenome. Impact This study reveals that repetitive neonatal procedural pain increases DNA methylation of the Mor-1 promoter in the spinal cord of neonatal rats. This is the first study to identify an effect of neonatal procedural pain on DNA methylation, emphasizing the critical need for further investigation into the epigenetic consequences of neonatal procedural pain. These insights could lead to better management and treatment strategies to mitigate the long-term impacts of early pain exposure on neurodevelopment and behavior.

Background: Deep brain stimulation (DBS) of the nucleus basalis of Meynert (NBM) has shown to have promising results in a pilot study with patients suffering from Alzheimer's disease (AD). A recent study in aged monkeys shows a novel intermittent stimulation pattern to have superior cognitive benefits over continuous paradigms. Objective/Hypothesis: We aimed at comparing the cognitive effects elicited by intermittent and continuous NBM stimulation paradigms in an animal model for AD (TgF344-AD rat line; TG), i.e. rats expressing mutant human amyloid precursor protein (APPsw) and presenilin 1 (PS1ΔE9) genes, each independent causes of early-onset familial AD. Methods: In this exploratory study, aged APP/PS1 rats were tested pre-, and post implantation with several stimulation parameters, i.e. unilateral- or bilateral-intermittent, and bilateral-continuous, while performing various behavioral tasks (open field, novel object recognition, and modified Barnes maze). Results and Conclusion: Bilateral-intermittent NBM DBS allowed aged TG rats to perform better and maintain their performance longer in a spatial memory task, as compared to other conditions. These data support the notion that NBM DBS could be further refined in the clinic, thereby improving patient care.