Summary

 Locomotion exists in diverse forms in nature; however, little is known about how closely related species with similar neuronal circuitry can evolve different navigational strategies to explore their environments. Here, we investigate this question by comparing divergent swimming pattern in larval Danionella cerebrum (DC) and zebrafish (ZF). We show that DC displays long continuous swimming events when compared with the short burst-and-glide swimming in ZF. We reveal that mesencephalic locomotion maintenance neurons in the midbrain are sufficient to cause this increased swimming. Moreover, we propose that the availability of dissolved oxygen and timing of swim bladder inflation drive the observed differences in the swim pattern. Our findings uncover the neural substrate underlying the evolutionary divergence of locomotion and its adaptation to their environmental constraints.

Abstract The ability to measure synaptic connectivity and properties is essential for understanding neuronal circuits. However, existing methods that allow such measurements at cellular resolution are laborious and technically demanding. Here, we describe a system that allows such measurements in a high-throughput way by combining two-photon optogenetics and volumetric Ca 2+ imaging with whole-cell recording. We reveal a circuit motif for generating fast undulatory locomotion in zebrafish.

ABSTRACT Optogenetic neuronal network manipulation promises to at last unravel a long-standing mystery in neuroscience: how does microcircuit activity causally relate to behavioral and pathological states? The challenge to evoke spikes with high spatial and temporal complexity necessitates further joint development of light-delivery approaches and custom opsins. Two-photon scanning and parallel illumination strategies applied to ChR2- and C1V1-expressing neurons demonstrated reliable, in-depth generation of action potentials both in-vitro and in-vivo , but thus far lack the temporal precision necessary to induce precisely timed spiking events. Here, we show that efficient current integration enabled by two-photon holographic amplified laser illumination of Chronos, a highly light-sensitive and fast opsin, can evoke spikes with submillisecond precision and repeated firing up to 100 Hz. These results pave the way for optogenetic manipulation with the spatial and temporal sophistication necessary to mimic natural microcircuit activity.

Abstract The electric excitability of muscle, heart and brain tissue relies on the precise interplay of Na + - and K + -selective ion channels. The involved ion fluxes are controlled in optogenetic studies using light-gated channelrhodopsins (ChRs). While non-selective cation-conducting ChRs are well-established for excitation, K + -selective ChRs (KCRs) for efficient inhibition have only recently come into reach. Here, we report the molecular analysis of recently discovered KCRs from the stramenopile Hyphochytrium catenoides and identify a novel type of hydrophobic K + -selectivity filter. Next, we demonstrate that the KCR signature motif is conserved in related stramenopile ChRs. Among them, WiChR from Wobblia lunata features an unmatched 80-fold preference for K + over Na + , stable photocurrents under continuous illumination and a prolonged open state lifetime. Well expressed in neurons, WiChR allows two-photon inhibition at low irradiance and reduced tissue heating,_recommending WiChR as the long-awaited efficient and versatile optogenetic inhibitor.

Abstract Locomotion exists in diverse forms in nature and is adapted to the environmental constraints of each species 1 . However, little is known about how closely related species with similar neuronal circuitry can evolve different navigational strategies to explore their environments. We established a powerful approach in comparative neuroethology to investigate evolution of neuronal circuits in vertebrates by comparing divergent swimming pattern of two closely related larval fish species, Danionella translucida (DT) and Danio rerio or zebrafish (ZF) 2,3 . During swimming, we demonstrate that DT utilizes lower half tail-beat frequency and amplitude to generate a slower and continuous swimming pattern when compared to the burst-and-glide swimming pattern in ZF. We found a high degree of conservation in the brain anatomy between the two species. However, we revealed that the activity of a higher motor region, referred here as the Mesencephalic Locomotion Maintenance Neurons (MLMN) correlates with the duration of swim events and differs strikingly between DT and ZF. Using holographic stimulation, we show that the activation of the MLMN is sufficient to increase the frequency and duration of swim events in ZF. Moreover, we propose two characteristics, availability of dissolved oxygen and timing of swim bladder inflation, which drive the observed differences in the swim pattern. Our findings uncover the neuronal circuit substrate underlying the evolutionary divergence of navigational strategies and how they are adapted to their respective environmental constraints.

Understanding the intricate synaptic connectivity in living neural circuits is crucial for unraveling the relationship between network structure and function, as well as its evolution during development, learning, and recovery from injury. However, current methodologies for identifying connected neurons in vivo suffer from limitations, particularly with regards to their throughput. In this study, we introduce a groundbreaking framework for in vivo connectivity mapping that combines two-photon holographic optogenetics for activating single or multiple potential presynaptic neurons, whole-cell recording of postsynaptic responses, and a compressive sensing strategy for efficiently retrieving individual postsynaptic neurons9 responses when multiple potential presynaptic neurons are simultaneously activated. The approach was validated in the layer 2/3 of the visual cortex in anesthetized mice, enabling rapid probing of up to 100 cells in approximately 5 minutes. By identifying tens of synaptic pairs, including their connection strength, kinetics, and spatial distribution, this method showcases its potential to significantly advance circuit reconstruction in large neuronal networks with minimal invasiveness. Moreover, through simultaneous multi-cell stimulation and compressive sensing, we demonstrate up to a three-fold reduction in the number of required measurements to infer connectivity with limited loss in accuracy, thereby enabling high-throughput connectivity mapping in vivo. These results pave the way for a more efficient and rapid investigation of neuronal circuits, leading to deeper insights into brain function and plasticity.

Patterning light at the single-cell level over multiple neurons in the brain is crucial for optogenetic photostimulation that can recapitulate natural activity patterns and, thereby, determine the role of specific components of brain activity in behavior. To this end we have developed a method for projecting three-dimensional, 2-photon excitation patterns that are confined to many individual neurons. The new versatile optical scheme generates multiple extended excitation spots in a large volume with micrometric lateral and axial resolution. Two-dimensional temporally focused shapes are multiplexed several times over selected positions, thanks to the precise spatial phase modulation of the pulsed beam. This permits, under multiple configurations, the generation of tens of axially confined spots in an extended volume, spanning a range in depth of up to 500 μm. We demonstrate the potential of the approach by performing multi-cell volumetric excitation of photoactivatable GCaMP in the central nervous system of Drosophila larvae, a challenging structure with densely arrayed and small diameter neurons, and by photoconverting the fluorescent protein Kaede in zebrafish larvae. Our technique paves the way for the optogenetic manipulation of a large number of neurons in intact circuits.

Abstract The recent advances in sophisticated optical techniques, coupled with two-photon sensitive genetic voltage indicators (GEVIs), have enabled in-depth voltage imaging in vivo at single spike and single-cell resolution. To date, these results have been only achieved using ASAP-type sensors, as the complex photocycle of rhodopsin-based voltage indicators posed challenges for their two-photon use, restricting their application to one-photon approaches. In this work, we demonstrate that rhodopsin-based GEVIs (FRET-opsin) can be used under two-photon illumination when their peculiar light intensity dependence of kinetics and sensitivity are considered. We rationally engineer a fully genetically-encoded, rhodopsin-based voltage indicator with the brightest known fluorophore AaFP1, Jarvis, and demonstrate its utility under both one- and two-photon illumination. We also showed two-photon usability of the similar FRET-opsin sensor pAce. Our comparison of 2P scanless with fast 2P scanning illumination revealed that the latter approach is less suitable for this class of indicators and, on the contrary, both sensors responded well when scanless approaches were used. Furthermore, utilising Jarvis, we demonstrated high-fidelity, high-SNR action potential detection at kilohertz-imaging rates both in mouse hippocampal slices and in zebrafish larvae. To the best of our knowledge, this study represents the first report of a fully genetically-encoded rhodopsin-based voltage indicator for high contrast action potential detection under two-photon illumination in vitro and in vivo .