N-Heterocyclic carbenes, prepared in situ from diarylimidazolium salts, serve as highly effective catalysts for the generation of reactive homoenolates from α,β-unsaturated aldehydes. The catalyst-bound homoenolate reacts with electrophilic aldehydes leading, via the key intermediacy of an activated carboxylate, to γ-butyrolactones in good yields and stereoselectivities. Importantly, this process demonstrates an unprecedented reaction mode for the generation of nucleophilic carbanions with a multifunctional organocatalyst under exceptionally mild and convenient reaction conditions.

Catalytic reactions promoted by N-heterocyclic carbenes (NHCs) have exploded in popularity since 2004 when several reports described new fundamental reactions that extended beyond the long-studied generation of acyl anion equivalents. These new NHC-catalyzed reactions allow chemists to generate unique reactive species from otherwise inert starting materials, all under simple, mild reaction conditions and with exceptional selectivities. In analogy to transition metal catalysis, the use of NHCs has introduced a new set of elementary steps that operate via discrete reactive species, including acyl anion, homoenolate, and enolate equivalents, usually generated by oxidation state reorganization ("redox neutral" reactions). Nearly all NHC-catalyzed reactions offer operationally simple reactions, proceed at room temperature without the need for stringent exclusion of air, and do not generate reaction byproducts. Variation of the catalyst or reaction conditions can profoundly influence reaction outcomes, and researchers can tune the desired selectivities through careful choice of NHC precursor and base. The catalytically generated homoenolate and enolate equivalents are nucleophilic species. In contrast, the catalytically generated acyl azolium and α,β-unsaturated acyl azoliums are electrophilic cationic species with unique and unprecedented chemistry. For example, when generated catalytically, these species transformed an α-functionalized aldehyde to an ester under redox neutral conditions without coupling reagents or waste. In addition to providing new approaches to catalytic esterifications, acyl azoliums offer unique reactivities that chemists can exploit for selective reactions. This Account focuses on the discovery and mechanistic investigation of the catalytic generation of acyl azoliums and α,β-unsaturated acyl azoliums. These chemical species are fascinating, and their catalytic generation is an important development. Studies of their unusual chemistry, however, date back to the intense investigation of thiamine-dependent enzymatic processes in the 1960s. Acyl azoliums are remarkably reactive in acylation chemistry and are unusually chemoselective. These two properties have led to a new wave of reactions such as redox esterification reaction (1) and the catalytic kinetic resolution of challenging substrates (i.e., 3). Our group and others have also developed methods to generate and exploit α,β-unsaturated acyl azoliums, which have facilitated new C-C bond-forming annulations, including a catalytic, enantioselective variant of the Claisen rearrangement (2). From essentially one class of catalysts, the N-mesityl derived triazolium salts, researchers can easily prepare highly enantioenriched dihydropyranones and dihydropyridinones. Although this field is now one of the most explored areas of enantioselective C-C bond forming reactions, many mechanistic details remained unsolved and in dispute. In this Account, we address the mechanistic inquiries about the characterization of the unsaturated acyl triazolium species and its kinetic profile under catalytically relevant conditions. We also provide explanations for the requirement and effect of the N-mesityl group in NHC catalysis based on detailed experimental data within given specific reactions or conditions. We hope that our studies provide a roadmap for catalyst design/selection and new reaction discovery based on a fundamental understanding of the mechanistic course of NHC reactions.

Highly enantioselective, N-heterocyclic carbene (NHC)-catalyzed aza-Diels−Alder reactions are described. A novel chiral triazolium salt based on the cis-1,2-aminoindanol platform serves as an efficient precatalyst for the NHC-catalyzed redox generation of enolate dienophiles that undergo LUMOdiene-controlled Diels−Alder reactions with N-sulfonyl-α,β-unsaturated imines in good yields and with exceptional diastereo- and enantioselectivities (>99% ee). In contrast to uncatalyzed variants, this organocatalytic process proceeds at room temperature without stoichiometric reagents, producing synthetically valuable, enantiomerically pure cis-3,4-disubstituted dihydropyridinone products.

Additive-free: The chemoselective amide-bond-forming ligation between N-alkylhydroxylamines and α-ketoacids requires no reagents and the only by-products are water and carbon dioxide. This process proceeds on unprotected peptide substrates without epimerization, and as such, this process has the potential to serve as a novel chemoselective ligation for the synthesis of peptides and complex materials. Chemoselective ligation reactions make possible covalent bond formation between two fragments containing unprotected functional groups. An ideal ligation process proceeds under mild, often aqueous, conditions at low molar concentrations, does not require reagents or catalysts, and produces no chemical by-products.1 The few known reactions that approach these criteria, including oxime formation,2 thioester-α-bromocarbonyl alkylations,3 and the copper-promoted alkyne–azide cycloaddition4 have found diverse and significant applications in drug discovery,5 functionalized polymer synthesis,6 and the fabrication of novel nanostructures.7 Their utility in biomolecule synthesis, however, is limited by the fact that they produce unnatural, and often relatively labile, covalent bonds. The development of chemical ligation reactions that create amide bonds have been a long standing goal.8 The identification of the native chemical ligation of C-terminal peptide thioesters and N-terminal cysteines has revolutionized the field of synthetic protein chemistry by making possible the coupling of large, unprotected-peptide fragments.9, 10 Despite the utility of this process, the requirement of ligation at relatively rare cysteine residues has encouraged investigations into alternative amide bond-forming reactions.11, 12 The discovery of this reaction stemmed from our efforts to develop new approaches to amide and ester synthesis by intramolecular redox reactions of aldehydes.13 We reasoned that intermolecular redox reactions, for example, between an aldehyde and a hydroxylamine, could also lead to amide formation under appropriate conditions (Scheme 1). These studies, however, were complicated by the propensity of aldehydes and hydroxylamines to rapidly form nitrones. In contrast, ketones rarely condense with N-alkylhydroxylamines under mild conditions. Instead, metastable hemiaminals are formed,14 and we hypothesized that N-alkylhydroxylamines would react with α-ketoacids to produce a hemiaminal poised for oxidative decarboxylation to give amide products.15 Reactions of N-alkylhydroxylamines with aldehydes and ketones. Entry Conditions[a] t [h] Yield[b] [%] 1 DMF, hydroxylamine free base 15 70 2 DMF 15 79 (88)[c] 3 DMF, ketoacid sodium salt 15 75 4 MeOH 24 72 5 DMSO 15 80 6 DMF/H2O (5:1) 15 72 (77)[c] 7 acetate buffer (pH 4) 24 (70)[c] 8 6 n NH4Cl, 60 °C 15 68 (70)[c] Ketoacid–hydroxylamine ligations of peptide substrates 4 and 5. a) Demonstration of preservation of stereochemistry during the reaction; b) Monitoring of the reaction by HPLC (samples taken directly from the reaction mixture without purification or workup). A small amount of the carboxylic acid is formed during the synthesis of ketoacid 4. Cbz=carbobenzyloxycarbonyl. Entry Ketoacid Hydroxylamine Product[a] Yield[b] [%] 1 FmocAlaPro AlaOtBu Fmoc-AlaProAla-OtBu 72 2 FmocAlaVal GlyOEt Fmoc-AlaValGly-OEt 58 3 FmocLys(Boc)-Glu(tBu)PheAla AlaOtBu Fmoc-Lys(Boc)Glu(tBu)Phe-AlaAla-OtBu[c] 80 4 H2N-LysAlaPhe AlaAsp(tBu)PheOtBu H2N-LysAlaPhe-AlaAsp(tBu)Phe-OtBu 74 5 FmocAspAlaPhe AlaAsp(tBu)PheOtBu Fmoc-AspAlaPhe-AlaAsp(tBu)PheOtBu 74 Several possible reaction pathways can give rise to amide formation, and we have initiated efforts to elucidate the reaction mechanism. Interestingly, although peptide substrates such as 4 and 5 do not appear to condense to form nitrones under the reaction conditions (Figure 1 b), less-hindered substrates, including our model reaction [Eq. (2)], rapidly form the isomeric nitrones cis-11 and trans-11 (Figure 2). These nitrone intermediates were detected by reverse-phase HPLC (Figure 2 b), liquid chromatography–MS, and in situ 1H and 13C NMR spectroscopy studies of the reaction mixtures. They could be isolated as their methyl esters by being trapped with diazomethane. Although it is clear that these nitrones can form under the reaction conditions, we do not currently believe that they are involved in product formation; all attempts to trap the postulated nitrilium ion 12 by the addition of nucleophiles (MeOH as the reaction solvent, thiophenol, cysteine, glycine) afforded only the usual amide product. Thus, although the rapid formation of nitrone 11 may contribute to the efficiency of the reaction, conversion to the product is likely to proceed through decarboxylation of the tetrahedral intermediate 10. The question of whether the decarboxylation proceeds through a stepwise or concerted pathway remains to be addressed, although the isolation of small amounts of nitrone 15 suggests that a stepwise reaction is at least a possibility. We note, however, that decarboxylated nitrones are never isolated when peptide-derived ketoacids and hydroxylamines are employed. Although the details remain to be elucidated, the available evidence points to a distinct mechanistic manifold that may have further implications including a role in the prebiotic origin of higher peptides. a) Possible reaction pathways for amide formation; b) detection of nitrone intermediates by HPLC. This chemoselective amide formation is not limited to O-unsubstituted hydroxylamines. For example, N-methoxy peptide 16 was coupled with 2-ketobutyric acid in acetonitrile in 61 % yield (Scheme 2 a).19 Unexpectedly, and in contrast to the O-unsubstituted hydroxylamines, these substrates required added acid and showed increased efficiency in acetronitrile, but were slower in the presence of DMF, DMSO, or water. Cyclic hydroxylamines are exceptional substrates (Scheme 2 b); isoxazolidine 18 reacted cleanly with α-ketoacids in either nonpolar (CH2Cl2, toluene) or aqueous (0.2 M 1:1 tBuOH/H2O) conditions. The stability of the resultant ketoester product under the reaction conditions is noteworthy.20 Amide-forming ketoacid ligations with O-alkyl hydroxylamines. The coupling of α-ketoacids and hydroxylamines is a powerful, chemoselective amide bond formation that proceeds in the presence of reactive functional groups, requires no reagents or catalysts, and produces only water and CO2 as by-products. This reaction should be useful for diverse applications that require the coupling of unprotected molecules. Supporting information for this article is available on the WWW under http://www.wiley-vch.de/contents/jc_2002/2006/z503991_s.pdf or from the author. Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.

Abstract Programmed ribosomal frameshifting is the key event during translation of the SARS-CoV-2 RNA genome allowing synthesis of the viral RNA-dependent RNA polymerase and downstream viral proteins. Here we present the cryo-EM structure of the mammalian ribosome in the process of translating viral RNA paused in a conformation primed for frameshifting. We observe that the viral RNA adopts a pseudoknot structure lodged at the mRNA entry channel of the ribosome to generate tension in the mRNA that leads to frameshifting. The nascent viral polyprotein that is being synthesized by the ribosome paused at the frameshifting site forms distinct interactions with the ribosomal polypeptide exit tunnel. We use biochemical experiments to validate our structural observations and to reveal mechanistic and regulatory features that influence the frameshifting efficiency. Finally, a compound previously shown to reduce frameshifting is able to inhibit SARS-CoV-2 replication in infected cells, establishing coronavirus frameshifting as target for antiviral intervention.

Abstract Macroautophagy is one of two major degradation systems in eukaryotic cells. Regulation and control of autophagy is often achieved through the presence of short peptide sequences called LC3 interacting regions (LIR) in autophagy-involved proteins. Using a combination of new protein-derived activity-based probes, protein modelling and X-ray crystallography, we identified a non-canonical LIR motif in the human E2 enzyme responsible for LC3 lipidation, ATG3. The LIR motif is present in the flexible region of ATG3 and adopts an uncommon β-sheet structure binding to the backside of LC3. We show that the β-sheet conformation is crucial for its interaction with LC3. In cellulo studies provide evidence that LIR ATG3 is required for LC3 lipidation and ATG3∼LC3 thioester formation. Removal of LIR ATG3 negatively impacts the rate of thioester transfer from ATG7 to ATG3. Abstract Figure

Abstract Purpose The angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) plays a regulatory role in the cardiovascular system and serves SARS-CoV-2 as an entry receptor. The aim of this study was to synthesize and evaluate radiofluorinated derivatives of the ACE2 inhibitor MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were demonstrated to be suitable for non-invasive imaging of ACE2, potentially enabling a better understanding of its expression dynamics. Methods Based on computational molecular modeling, the ACE2-binding modes of F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 were similar to that of MLN-4760. Co-crystallization of the hACE2/F-MLN-4760 protein complex was performed for confirmation. Displacement experiments using [ 3 H]MLN-4760 enabled the determination of the binding affinities of the synthesized F-MLN-4760 and F-Aza-MLN-4760 to ACE2 expressed in HEK-ACE2 cells. Aryl trimethylstannane-based and pyridine-based radiofluorination precursors were synthesized and used for the preparation of the respective radiotracers. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were evaluated with regard to the uptake in HEK-ACE2 and HEK-ACE cells and in vitro binding to tissue sections of HEK-ACE2 xenografts and normal organs of mice. Biodistribution and PET/CT imaging studies of [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were performed using HEK-ACE2 and HEK-ACE xenografted nude mice. Results Crystallography data revealed an equal ACE2-binding mode for F-MLN-4760 as previously found for MLN-4760 and indicated that the same would hold true for F-Aza-MLN-4760. The IC 50 values were all in the high nM range, but three-fold lower for F-MLN-4760 and seven-fold lower for F-Aza-MLN-4760 than for MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 were obtained in 1.4 ± 0.3 GBq and 0.5 ± 0.1 GBq activity with >99% radiochemical purity in a 5.3% and 1.2% radiochemical yield, respectively. Uptake in HEK-ACE2 cells was higher for [ 18 F]F-MLN-4760 (67 ± 9%) than for [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 (37 ± 8%) after 3 h incubation while negligible uptake was seen in HEK-ACE cells (<0.3%). [ 18 F]F-MLN-4760 and [ 18 F]F-Aza-MLN-4760 accumulated specifically in HEK-ACE2 xenografts of mice (13 ± 2% IA/g and 15 ± 2% IA/g at 1 h p.i.) with almost no uptake observed in HEK-ACE xenografts (<0.3% IA/g). This was confirmed by PET/CT imaging, which also visualized unspecific accumulation in the gall bladder and intestinal tract. Conclusion Both radiotracers showed specific and selective binding to ACE2 in vitro and in vivo. [ 18 F]F-MLN-4760 was, however, obtained in higher yields and the ACE2-binding affinity was superior over that of [ 18 F]F-Aza-MLN-4760. [ 18 F]F-MLN-4760 would, thus, be the candidate of choice for further developlment to enable PET imaging of ACE2 in patients.

Abstract Delineating the molecular nanoscale organization of the surfaceome is pre-requisite for understanding cellular signaling. Technologies for mapping the spatial relationships of cell surface receptors and their extracellular signaling synapses would open up theranostic opportunities and the possibility to engineer extracellular signaling. Here, we developed an optoproteomic technology termed LUX-MS that exploits singlet oxygen generators (SOG) for the light-triggered identification of acute protein interactions on living cells. Using SOG-coupled antibodies, small molecule-drugs, biologics and intact viral particles, we show that not only ligand-receptor interactions can be decoded across organisms, but also the surfaceome receptor nanoscale organization ligands engage in with direct implications for drug action. Furthermore, investigation of functional immunosynapses revealed that intercellular signaling inbetween APCs and CD8 + T cells can be mapped now providing insights into T cell activation with spatiotemporal resolution. LUX-MS based decoding of surfaceome signaling architectures provides unprecedented molecular insights for the rational development of theranostic strategies.

Abstract During normal cellular homeostasis unfolded and mis-localized proteins are recognized and removed, preventing the build-up of toxic byproducts 1 . When protein homeostasis is perturbed during aging, neurodegeneration or cellular stress, proteins can accumulate several forms of chemical damage through reactive metabolites 2, 3 . Such modifications have been proposed to trigger the selective removal of chemically marked proteins 3–6; however, discovering modifications sufficient to induce protein degradation has remained challenging. Using a semi-synthetic chemical biology approach coupled to cellular assays, we found that C-terminal amide-bearing proteins (CTAPs) are rapidly cleared from human cells. A CRISPR screen identified the SCF/FBXO31 ubiquitin ligase as a reader of C-terminal amides, which ubiquitylates CTAPs for subsequent proteasomal degradation. A conserved binding pocket enables FBXO31 to bind almost any C-terminal peptide bearing an amide while retaining exquisite selectivity over non-modified clients. This mechanism facilitates binding and turnover of endogenous CTAPs that are formed following oxidative stress. A dominant human mutation found in neurodevelopmental disorders switches CTAP recognition, such that non-amidated neosubstrates are now degraded and FBXO31 becomes markedly toxic. We propose that CTAPs may represent the vanguard of a largely unexplored class of modified amino acid degrons that could provide a general strategy for selective yet broad surveillance of chemically damaged proteins.

Three-dimensional (3D) control over the placement of bioactive cues is fundamental to understand cell guidance and develop engineered tissues. Two-photon patterning (2PP) provides such placement at micro- to millimeter scale, but non-specific interactions between proteins and functionalized extracellular matrices (ECMs) restrict its use. Here we report a 2PP system based on non-fouling hydrophilic photocages and Sortase A-based enzymatic coupling offering unprecedented orthogonality and signal-to-noise ratio in both inert hydrogels and complex mammalian matrices. Improved photocaged peptide synthesis, and protein functionalization protocols with broad applicability are introduced. Importantly, the method enables 2PP in a single step and in the presence of fragile biomolecules and cells. As a corollary, we demonstrate the guidance of axons through 3D-patterned nerve growth factor (NGF) within brain-mimetic ECMs. Our approach allows for the interrogation of the role of complex signaling molecules in 3D matrices, thus helping to better understand biological guidance in tissue development and regeneration.