Highly regulated programs for airway epithelial cell proliferation and differentiation during development and repair are often disrupted in disease. These processes have been studied in mouse models; however, it is difficult to isolate and identify epithelial cell-specific responses in vivo. To investigate these processes in vitro, we characterized a model for primary culture of mouse tracheal epithelial cells. Small numbers of cells seeded at low density (7.5 × 10 4 cells/cm 2 ) rapidly proliferated and became polarized. Subsequently, supplemented media and air-liquid interface conditions resulted in development of highly differentiated epithelia composed of ciliated and nonciliated cells with gene expression characteristic of native airways. Genetically altered or injured mouse tracheal epithelial cells also reflected in vivo patterns of airway epithelial cell gene expression. Passage of cells resulted in continued proliferation but limited differentiation after the first passage, suggesting that transit-amplifying cell populations were present but with independent programs for proliferation and differentiation. This approach provides a high-fidelity in vitro model for evaluation of gene regulation and expression in mouse airway epithelial cells.

Recent human infections caused by the highly pathogenic avian influenza virus H5N1 strains emphasize an urgent need for assessment of factors that allow viral transmission, replication, and intra-airway spread. Important determinants for virus infection are epithelial cell receptors identified as glycans terminated by an alpha2,3-linked sialic acid (SA) that preferentially bind avian strains and glycans terminated by an alpha2,6-linked SA that bind human strains. The mouse is often used as a model for study of influenza viruses, including recent avian strains; however, the selectivity for infection of specific respiratory cell populations is not well described, and any relationship between receptors in the mouse and human lungs is incompletely understood. Here, using in vitro human and mouse airway epithelial cell models and in vivo mouse infection, we found that the alpha2,3-linked SA receptor was expressed in ciliated airway and type II alveolar epithelial cells and was targeted for cell-specific infection in both species. The alpha2,6-linked SA receptor was not expressed in the mouse, a factor that may contribute to the inability of some human strains to efficiently infect the mouse lung. In human airway epithelial cells, alpha2,6-linked SA was expressed and functional in both ciliated and goblet cells, providing expanded cellular tropism. Differences in receptor and cell-specific expression in these species suggest that differentiated human airway epithelial cell cultures may be superior for evaluation of some human strains, while the mouse can provide a model for studying avian strains that preferentially bind only the alpha2,3-linked SA receptor.

Little information describing common cocaine-related medical problems is available. This study examined the nature, frequency, treatment, incidence of complications, and emergency department deaths of patients seeking medical care for acute and chronic cocaine-associated medical problems.A consecutive series of 233 hospital visits by 216 cocaine-using patients over a 6-month period during 1986 and 1987 was studied. Medical records were retrospectively reviewed to determine patient characteristics, nature of complications, treatment, and outcome.Patients most commonly used cocaine intravenously (49%), but freebase or crack use was also common (23.3%). Concomitant abuse of other intoxicants, especially alcohol, was frequently seen (48.5%). The vast majority of complaints were cardiopulmonary (56.2%), neurologic (39.1%), and psychiatric (35.8%); multiple symptoms were often present (57.5%). The most common complaint was chest pain though rarely was it believed to represent ischemia. Altered mental status was common (27.4%) and ranged from psychosis to coma. Short-term pharmacologic intervention was necessary in only 24% of patients, and only 9.9% of patients were admitted. Acute mortality was less than 1%.Most medical complications of cocaine are short-lived and appear to be related to cocaine's hyperadrenergic effects. Patients usually do not require short-term therapy or hospital admission. Acute morbidity and mortality rates from cocaine use in patients presenting to the hospital are very low, suggesting that a major focus in the treatment of cocaine-related emergencies should be referral for drug abuse detoxification and treatment.

Chronic obstructive lung disease is characterized by persistent abnormalities in epithelial and immune cell function that are driven, at least in part, by infection. Analysis of parainfluenza virus infection in mice revealed an unexpected role for innate immune cells in IL-13–dependent chronic lung disease, but the upstream driver for the immune axis in this model and in humans with similar disease was undefined. We demonstrate here that lung levels of IL-33 are selectively increased in postviral mice with chronic obstructive lung disease and in humans with very severe chronic obstructive pulmonary disease (COPD). In the mouse model, IL-33/IL-33 receptor signaling was required for Il13 and mucin gene expression, and Il33 gene expression was localized to a virus-induced subset of airway serous cells and a constitutive subset of alveolar type 2 cells that are both linked conventionally to progenitor function. In humans with COPD, IL33 gene expression was also associated with IL13 and mucin gene expression, and IL33 induction was traceable to a subset of airway basal cells with increased capacities for pluripotency and ATP-regulated release of IL-33. Together, these findings provide a paradigm for the role of the innate immune system in chronic disease based on the influence of long-term epithelial progenitor cells programmed for excess IL-33 production.

SARS-CoV-2 utilizes a number of strategies to modulate viral and host mRNA translation. Here, we used ribosome profiling in SARS-CoV-2 infected model cell lines and primary airway cells grown at the air-liquid interface to gain a deeper understanding of the translationally regulated events in response to virus replication. We find that SARS-CoV-2 mRNAs dominate the cellular mRNA pool but are not more efficiently translated than cellular mRNAs. SARS-CoV-2 utilized a highly efficient ribosomal frameshifting strategy in comparison to HIV-1, suggesting utilization of distinct structural elements. In the highly permissive cell models, although SARS-CoV-2 infection induced the transcriptional upregulation of numerous chemokines, cytokines and interferon stimulated genes, many of these mRNAs were not translated efficiently. Impact of SARS-CoV-2 on host mRNA translation was more subtle in primary cells, with marked transcriptional and translational upregulation of inflammatory and innate immune responses and downregulation of processes involved in ciliated cell function. Together, these data reveal the key role of mRNA translation in SARS-CoV-2 replication and highlight unique mechanisms for therapeutic development.

ABSTRACT Established in vitro models for SARS-CoV-2 infection are limited and include cell lines of non-human origin and those engineered to overexpress ACE2, the cognate host cell receptor. We identified human H522 lung adenocarcinoma cells as naturally permissive to SARS-CoV-2 infection despite complete absence of ACE2. Infection of H522 cells required the SARS-CoV-2 spike protein, though in contrast to ACE2-dependent models, spike alone was not sufficient for H522 infection. Temporally resolved transcriptomic and proteomic profiling revealed alterations in cell cycle and the antiviral host cell response, including MDA5-dependent activation of type-I interferon signaling. Focused chemical screens point to important roles for clathrin-mediated endocytosis and endosomal cathepsins in SARS-CoV-2 infection of H522 cells. These findings imply the utilization of an alternative SARS-CoV-2 host cell receptor which may impact tropism of SARS-CoV-2 and consequently human disease pathogenesis.

Abstract Ciliary motility is driven by axonemal dyneins that are assembled in the cytoplasm before deployment to cilia. Motile ciliopathy can result from defects in the dyneins themselves or from defects in factors required for their cytoplasmic pre-assembly. Recent work demonstrates that axonemal dyneins, their specific assembly factors, and broadly acting chaperones are concentrated in liquid-like organelles in the cytoplasm called DynAPs (Dynein Axonemal Particles). Here, we use in vivo imaging to show that inner dynein arm (IDA) and outer dynein arm (ODA) subunits are partitioned into non-overlapping sub-regions within DynAPs. Using affinity purification mass-spectrometry of in vivo interaction partners, we also identify novel partners for inner and outer dynein arms. Among these, we identify C16orf71/Daap1 as a novel axonemal dynein regulator. Daap1 interacts with ODA subunits, localizes specifically to the cytoplasm, is enriched in DynAPs, and is required for the deployment of ODAs to axonemes. Our work reveals a new complexity in the structure and function of a cell-type specific liquid-like organelle that is directly relevant to human genetic disease.

Summary Motile cilia have essential cellular functions in development, reproduction, and homeostasis. Genetic causes for motile ciliopathies have been identified, but the consequences on cellular functions beyond impaired motility remain unknown. Variants in CCDC39 and CCDC40 cause severe disease not explained by loss of motility. Using human cells with pathological variants in these genes, Chlamydomonas genetics, cryo-electron microscopy, single cell RNA transcriptomics, and proteomics, we identified perturbations in multiple cilia-independent pathways. Absence of the axonemal CCDC39/CCDC40 heterodimer results in loss of a connectome of over 90 proteins. The undocked connectome activates cell quality control pathways, switches multiciliated cell fate, impairs microtubule architecture, and creates a defective periciliary barrier. Both cilia-dependent and independent defects are likely responsible for the disease severity. Our findings provide a foundation for reconsidering the broad cellular impact of pathologic variants in ciliopathies and suggest new directions for therapies.

Abstract Motile cilia project from the airway apical surface and directly interface with inhaled external environment. Due to cilia’s nanoscale dimension and high beating frequency, quantitative assessment of their motility remains a sophisticated task. Here we described a robust approach for reproducible engineering of apical-out airway organoid (AOAO) of defined size. Propelled by exterior-facing cilia beating, the mature AOAO exhibited stable rotational motion when surrounded by Matrigel. We developed a computational framework leveraging computer vision algorithms to quantify AOAO rotation and validated its correlation with direct measurement of cilia motility. We further established the feasibility of using AOAO rotation to recapitulate and measure defective cilia motility caused by chemotherapy-induced toxicity and by CCDC39 mutations in cells from primary ciliary dyskinesia patient. We expect our rotating AOAO model and the associated computational pipeline to offer a generalizable framework to expediate modeling of and therapeutic development for genetic and environmental ciliopathies.