Abstract Phenotypic heterogeneity of cancer cells plays a critical role in shaping treatment response. This type of heterogeneity is organized spatially with specific phenotypes, such as sharply demarcated clusters of proliferating and cell cycle-arrested cells, predominating within discrete domains within a tumor. What determines the occurrence of specific tumor cell phenotypes in distinct microdomains of solid cancers is poorly understood. Here, we show that in melanoma spatial organization of phenotypic heterogeneity is dictated by the expression and activity of MITF. We reveal that this lineage survival oncogene controls ECM composition and organization, and ROCK-driven mechanotransduction through focal adhesion maturation and actin cytoskeleton functionality. In turn, altered tumor microarchitecture and structural integrity impact tumor solid stress which then mediates phenotypic heterogeneity through p27 Kip1 . Rho-ROCK-myosin signaling is necessary to transmit the effect of the reciprocal cell-ECM regulation into phenotypic heterogeneity. Our findings place cell-ECM crosstalk as a central driver of phenotypic tumor heterogeneity. Significance Phenotypic heterogeneity is a major culprit of cancer therapy failure. We demonstrate that phenotypic heterogeneity is controlled through tumor cell-ECM crosstalk resulting in altered tumor microarchitecture, mechanotransduction and Rho-ROCK-myosin signaling. Melanoma shares these physical properties with any solid cancer underscoring the importance of our findings for therapeutically targeting this phenomenon.

Summary Cells migrating through complex 3D environments experience considerable physical challenges including tensile stress and compression. To move, cells need to resist these forces whilst also squeezing the large nucleus through confined spaces. This requires highly coordinated cortical contractility. Microtubules can both resist compressive forces and sequester key actomyosin regulators to ensure appropriate activation of contractile forces. Yet, how these two roles are integrated to achieve nuclear transmigration in 3D is largely unknown. Here, we demonstrate that compression triggers reinforcement of a dedicated microtubule structure at the rear of the nucleus by the mechanoresponsive recruitment of CLASPs (cytoplasmic linker-associated proteins) which dynamically strengthens and repairs the lattice. These reinforced microtubules form the mechanostat: an adaptive feedback mechanism that allows the cell to both withstand compressive force and spatiotemporally organise contractility signalling pathways. The microtubule mechanostat facilitates nuclear positioning and coordinates force production to enable the cell to pass through constrictions. Disruption of the mechanostat imbalances cortical contractility, stalling migration and ultimately resulting in catastrophic cell rupture. Our findings reveal a new role for microtubules as cellular sensors which detect and respond to compressive forces, enabling movement and ensuring survival in mechanically demanding environments. One Sentence Summary Mechanically tuned microtubules form a mechanostat to coordinate contractility and nuclear positioning in confined migration.

Abstract Tumour spheroids are common in vitro experimental models of avascular tumour growth. Compared with traditional two-dimensional culture, tumour spheroids more closely mimic the avascular tumour microenvironment where spatial differences in nutrient availability strongly influence growth. We show that spheroids initiated using significantly different numbers of cells grow to similar limiting sizes, suggesting that avascular tumours have a limiting structure; in agreement with untested predictions of classical mathematical models of tumour spheroids. We develop a novel mathematical and statistical framework to study the structure of tumour spheroids seeded from cells transduced with fluorescent cell cycle indicators, enabling us to discriminate between arrested and cycling cells and identify an arrested region. Our analysis shows that transient spheroid structure is independent of initial spheroid size, and the limiting structure can be independent of seeding density. Standard experimental protocols compare spheroid size as a function of time; however, our analysis suggests that comparing spheroid structure as a function of overall size produces results that are relatively insensitive to variability in spheroid size. Our experimental observations are made using two melanoma cell lines, but our modelling framework applies across a wide range of spheroid culture conditions and cell lines.

Abstract Tumour spheroid experiments are routinely used to study cancer progression and treatment. Various and inconsistent experimental designs are used, leading to challenges in interpretation and reproducibility. Using multiple experimental designs, live-dead cell staining, and real-time cell cycle imaging, we measure necrotic and proliferation-inhibited regions in over 1000 4D tumour spheroids (3D space plus cell cycle status). By intentionally varying the initial spheroid size and temporal sampling frequencies across multiple cell lines, we collect an abundance of measurements of internal spheroid structure. These data are difficult to compare and interpret. However, using an objective mathematical modelling framework and statistical identifiability analysis we quantitatively compare experimental designs and identify design choices that produce reliable biological insight. Measurements of internal spheroid structure provide the most insight, whereas varying initial spheroid size and temporal measurement frequency is less important. Our general framework applies to spheroids grown in different conditions and with different cell types.

Abstract Melanoma is a highly plastic tumor characterized by dynamic interconversion of different cell identities depending on the biological context. For example, melanoma cells with high expression of the H3K4 demethylase KDM5B (JARID1B) rest in a slow-cycling, yet reversible persister state. Over time, KDM5B high cells can promote rapid tumor repopulation with equilibrated KDM5B expression heterogeneity. The cellular identity of KDM5B high persister cells has not been studied so far, missing an important cell state-directed treatment opportunity in melanoma. Here, we have established a doxycycline-titratable system for genetic induction of permanent intratumor expression of KDM5B and screened for chemical agents that phenocopy this effect. Transcriptional profiling and cell functional assays confirmed that the dihydropyridine phenoxyethyl 4-(2-fluorophenyl)-2,7,7-trimethyl-5-oxo-1,4,5,6,7,8-hexa-hydro-quinoline-3-carboxylate (termed Cpd1) supports high KDM5B expression and directs melanoma cells towards differentiation along the melanocytic lineage and to cell cycle-arrest. The high KDM5B state additionally prevents cell proliferation through negative regulation of cytokinetic abscission. Moreover, treatment with Cpd1 promoted the expression of the melanocyte-specific tyrosinase gene specifically sensitizing melanoma cells for the tyrosinase-processed antifolate prodrug 3-O-(3,4,5-trimethoxybenzoyl)-(-)-epicatechin (TMECG). In summary, our study provides proof-of-concept for a new dual hit strategy in melanoma, in which persister state-directed transitioning limits tumor growth and plasticity and primes melanoma cells towards lineage-specific elimination.

Abstract Tumours are subject to external environmental variability. However, in vitro tumour spheroid experiments, used to understand cancer progression and develop cancer therapies, have been routinely performed for the past fifty years in constant external environments. Furthermore, spheroids are typically grown in ambient atmospheric oxygen (normoxia), whereas most in vivo tumours exist in hypoxic environments. Therefore, there are clear discrepancies between in vitro and in vivo conditions. We explore these discrepancies by combining tools from experimental biology, mathematical modelling, and statistical uncertainty quantification. Focusing on oxygen variability to develop our framework, we reveal key biological mechanisms governing tumour spheroid growth. Growing spheroids in time-dependent conditions, we identify and quantify novel biological adaptation mechanisms, including unexpected necrotic core removal, and transient reversal of the tumour spheroid growth phases.

Abstract Co-culture tumour spheroid experiments are routinely performed to investigate cancer progression and test anti-cancer therapies. Therefore, methods to quantitatively characterise and interpret coculture spheroid growth are of great interest. However, co-culture spheroid growth is complex. Multiple biological processes occur on overlapping timescales and different cell types within the spheroid may have different characteristics, such as differing proliferation rates or responses to nutrient availability. At present there is no standard, widely-accepted mathematical model of such complex spatio-temporal growth processes. Typical approaches to analyse these experiments focus on the late-time temporal evolution of spheroid size and overlook early-time spheroid formation, spheroid structure and geometry. Here, using a range of ordinary differential equation-based mathematical models and parameter estimation, we interpret new co-culture experimental data. We provide new biological insights about spheroid formation, growth, and structure. As part of this analysis we connect Greenspan’s seminal mathematical model to co-culture data for the first time. Furthermore, we generalise a class of compartment-based spheroid mathematical models that have previously been restricted to one population so they can be applied to multiple populations. As special cases of the general model, we explore multiple natural two population extensions to Greenspan’s seminal model and reveal biological mechanisms that can describe the internal dynamics of growing co-culture spheroids and those that cannot. This mathematical and statistical modelling-based framework is well-suited to analyse spheroids grown with multiple different cell types and the new class of mathematical models provide opportunities for further mathematical and biological insights.

Abstract Three-dimensional (3D) in vitro tumour spheroid experiments are an important tool for studying cancer progression and potential drug therapies. Standard experiments involve growing and imaging spheroids to explore how different experimental conditions lead to different rates of spheroid growth. These kinds of experiments, however, do not reveal any information about the spatial distribution of the cell cycle within the expanding spheroid. Since 2008, a new experimental technology called fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI), has enabled real time in situ visualisation of the cell cycle progression. FUCCI labelling involves cells in G1 phase of the cell cycle fluorescing red, and cells in the S/G2/M phase of the cell cycle fluorescing green. Experimental observations of 3D tumour spheroids with FUCCI labelling reveal significant intratumoural structure, as the cell cycle status can vary with location. Although many mathematical models of tumour spheroid growth have been developed, none of the existing mathematical models are designed to interpret experimental observations with FUCCI labelling. In this work we extend the mathematical framework originally proposed by Ward and King (1997) to develop a new mathematical model of FUCCI-labelled tumour spheroid growth. The mathematical model treats the spheroid as being composed of three subpopulations: (i) living cells in G1 phase that fluoresce red; (ii) living cells in S/G2/M phase that fluoresce green; and, (iii) dead cells that do not fluoresce. We assume that the rates at which cells pass through different phases of the cell cycle, and the rate of cell death, depend upon the local oxygen concentration in the spheroid. Parameterising the new mathematical model using experimental measurements of cell cycle transition times, we show that the model can capture important experimental observations that cannot be addressed using previous mathematical models. Further, we show that the mathematical model can be used to quantitatively mimic the action of anti-mitotic drugs applied to the spheroid. All software required to solve the nonlinear moving boundary problem associated with the new mathematical model are available on GitHub .

Abstract We present a suite of experimental data showing that cell proliferation assays, prepared using standard methods thought to produce asynchronous cell populations, persistently exhibit inherent synchronisation. Our experiments use fluorescent cell cycle indicators to reveal the normally-hidden cell synchronisation by highlighting oscillatory subpopulations within the total cell population. These oscillatory subpopulations would never be observed without these cell cycle indicators. On the other hand, our experimental data show that the total cell population appears to grow exponentially, as in an asynchronous population. We reconcile these seemingly inconsistent observations by employing a multi-stage mathematical model of cell proliferation that can replicate the oscillatory subpopulations. Our study has important implications for understanding and improving experimental reproducibility. In particular, inherent synchronisation may affect the experimental reproducibility of studies aiming to investigate cell cycle-dependent mechanisms, including changes in migration and drug response.