Abstract Introgression of farmed salmon escapees into wild stocks is a major threat to the genetic integrity of wild populations. Using germ cell-free fish in aquaculture may mitigate this problem. Our study investigated whether it is possible to produce germ cell-free salmon in F0 by using CRISPR-Cas9 to knock out dnd , a factor required for germ cell survival in vertebrates. To avoid studying mosaic animals, sgRNA targeting alb was simultaneously used as a visual tracer since the phenotype of alb KO is complete loss of pigmentation. Induced mutations for the tracer ( alb ) and the target ( dnd ) genes were highly correlated and produced germ cell-less fish lacking pigmentation, underlining the suitability of alb KO to serve as tracer for targeted double allelic mutations in F0 animals in species with prohibitively long generation times. This is also the first report describing dnd knockout in any fish species. Analyzing gene expression and histology of dnd KO fish revealed that sex differentiation of the somatic compartment does not depend on the presence of germ cells. However, the organization of the ovarian somatic compartment seems compromised in mutant fish.

Wild and domesticated Atlantic salmon males display large variation for sea age at sexual maturation, which varies between 1–5 years. Previous studies have uncovered a genetic predisposition for variation of age at maturity with moderate heritability, thus suggesting a polygenic or complex nature of this trait. The aim of this study was to identify associated genetic loci, genes and ultimately specific sequence variants conferring sea age at maturity in salmon. We performed a genome wide association study (GWAS) using a pool sequencing approach (20 individuals per river and phenotype) of male salmon returning to rivers as sexually mature either after one sea winter (2009) or three sea winters (2011) in six rivers in Norway. The study revealed one major selective sweep, which covered 76 significant SNPs in which 74 were found in a 370 kb region of chromosome 25. Genotyping other smolt year classes of wild and domesticated salmon confirmed this finding. Genotyping domesticated fish narrowed the haplotype region to four SNPs covering 2386 bp, containing the vgll3 gene, including two missense mutations explaining 33–36% phenotypic variation. A single locus was found to have a highly significant role in governing sea age at maturation in this species. The SNPs identified may be both used as markers to guide breeding for late maturity in salmon aquaculture and in monitoring programs of wild salmon. Interestingly, a SNP in proximity of the VGLL3 gene in humans (Homo sapiens), has previously been linked to age at puberty suggesting a conserved mechanism for timing of puberty in vertebrates.

Understanding the biological function behind key proteins is of great concern in Atlantic salmon, both due to a high commercial importance and an interesting life history. Until recently, functional studies in salmonids appeared to be difficult. However, the recent discovery of targeted mutagenesis using the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated) system enables performing functional studies in Atlantic salmon to a great extent. We used the CRISPR/Cas9 system to target two genes involved in pigmentation, tyrosinase (tyr) and solute carrier family 45, member 2 (slc45a2). Embryos were assayed for mutation rates at the 17 somite stage, where 40 and 22% of all injected embryos showed a high degree of mutation induction for slc45a2 and tyr, respectively. At hatching this mutation frequency was also visible for both targeted genes, displaying a graded phenotype ranging from complete lack of pigmentation to partial loss and normal pigmentation. CRISPRslc45a2/Cas9 injected embryos showing a complete lack of pigmentation or just a few spots of pigments also lacked wild type sequences when assaying more than 80 (slc45a2) sequence clones from whole embryos. This indicates that CRISPR/Cas9 can induce double-allelic knockout in the F0 generation. However, types and frequency of indels might affect the phenotype. Therefore, the variation of indels was assayed in the graded pigmentation phenotypes produced by CRISPR/Cas9-slc45a2. The results show a tendency for fewer types of indels formed in juveniles completely lacking pigmentation compared to juveniles displaying partial pigmentation. Another interesting observation was a high degree of the same indel type in different juveniles. This study shows for the first time successful use of the CRISPR/Cas9 technology in a marine cold water species. Targeted double-allelic mutations were obtained and, though the level of mosaicism has to be considered, we demonstrate that F0 fish can be used for functional studies in Atlantic salmon.

Abstract Selective breeding programs in aquaculture are limited by the heritability of the trait and long generation time in most fish species. New breeding technology (NBT) using CRISPR/Cas9-induced homology directed repair (HDR) have the potential to expedite genetic improvement in aquaculture, but the method requires optimization. Here we show that asymmetrical oligonucleotide (ODN) donors induce highly efficient and precise edits in individual Atlantic salmon founder animals. We performed single nucleotide replacement (SNR) in dnd with up to 59.2% efficiency, and inserted FLAG elements into slc45a2 and dnd , with up to 36.7 % and 32.7% efficiency, respectively. We found HDR efficiency to be dependent on template concentration, but a trade-off with respect to toxicity was observed. Using this NBT in salmon we demonstrate that precise modification of the genome can be achieved in a single generation, allowing efficient introgression of favorable alleles and bypassing challenges associated with traditional selective breeding.

ABSTRACT The study of sex determination and sex chromosome organisation in non-model species has long been technically challenging, but new sequencing methodologies are now enabling precise and high-throughput identification of sex-specific genomic sequences. In particular, Restriction Site-Associated DNA Sequencing (RAD-Seq) is being extensively applied to explore sex determination systems in many plant and animal species. However, software designed to specifically search for sex-biased markers using RAD-Seq data is lacking. Here, we present RADSex, a computational analysis workflow designed to study the genetic basis of sex determination using RAD-Seq data. RADSex is simple to use, requires few computational resources, makes no prior assumptions about type of sex-determination system or structure of the sex locus, and offers convenient visualization through a dedicated R package. To demonstrate the functionality of RADSex, we re-analyzed a published dataset of Japanese medaka, Oryzias latipes , where we uncovered a previously unknown Y chromosome polymorphism. We then used RADSex to analyze new RAD-Seq datasets from 15 fish species spanning multiple systematic orders. We identified the sex determination system and sex-specific markers in six of these species, five of which had no known sex-markers prior to this study. We show that RADSex greatly facilitates the study of sex determination systems in non-model species and outperforms the commonly used RAD-Seq analysis software STACKS. RADSex in speed, resource usage, ease of application, and visualization options. Furthermore, our analysis of new datasets from 15 species provides new insights on sex determination in fish.

Wild and domesticated Atlantic salmon males display large variation for sea age at sexual maturation, which varies between 1-5 years. Previous studies have uncovered a genetic predisposition for age at maturity with moderate heritability, thus suggesting a polygenic or complex nature of this trait. The aim of this study was to identify associated genetic loci, genes and ultimately specific sequence variants conferring sea age at maturity in salmon. We performed a GWAS using a pool sequencing approach (20 individuals per river and trait) of salmon returning to rivers as sexually mature either after one sea winter (2009) or three sea winters (2011) in six rivers in Norway. The study revealed one major selective sweep, which covered 76 significant SNP in which 74 were found in a 370 kb region of chromosome 25. Genotyping other smolt year classes of wild salmon and domesticated salmon confirmed this finding. Genotyping domesticated fish narrowed the haplotype region to four SNPs covering 2386 bp, containing the vgll3 gene, including two missense mutations explaining 33-36% phenotypic variation. This study demonstrates a single locus playing a highly significant role in governing sea age at maturation in this species. The SNPs identified may be both used as markers to guide breeding for late maturity in salmon aquaculture and in monitoring programs of wild salmon. Interestingly, a SNP in proximity of the VGLL3 gene in human ( Homo sapiens ), has previously been linked to age at puberty suggesting a conserved mechanism for timing of puberty in vertebrates.

ABSTRACT Background Reproductive success and normal development in all animals are dependent on egg quality and developmental competence of the produced embryo. This study employed tandem mass tags labeling based liquid chromatography tandem mass spectrometry for egg proteomic profiling to investigate differences in the global proteome of good versus poor quality Atlantic halibut eggs at 1-cell stage post fertilization. Results A total of 115 proteins were found to be differentially abundant between good and poor quality eggs. Frequency distribution of these proteins revealed higher protein folding activity in good quality eggs in comparison to higher transcription and protein degradation activities in poor quality eggs ( p < 0.05). Poor quality halibut eggs were significantly enriched with additional proteins related to mitochondrial structure and biogenesis ( p < 0.05). The differential abundance of a selection of proteins was first confirmed at gene expression level using a transcriptomic approach followed by a targeted proteomic approach (parallel reaction monitoring based mass spectrometry) in biological samples obtained from two consecutive reproductive seasons. The findings of global proteome profiling, together with the validation of differential abundance of targeted proteins and their related genes, suggest impairments in protein and energy homeostasis which might be related to unfolded protein response and mitochondrial stress in poor quality eggs. Additional transmission electron microscopy studies were taken to assess potential differences in abundance and morphological integrity of mitochondria between good and poor quality eggs. Observations reveal poor quality eggs to contain significantly higher number of mitochondria with higher number of cristae. These mitochondria, however, are significantly smaller and have a more irregular shape than those found in high-quality eggs. Therewithal difference in mtDNA levels represented by mt-nd5 and mt-atp6 genomic DNA abundance in this study, were found to be not statistically significant ( p > 0.05) between good and bad quality eggs at both 1 hpf and 24 hpf stages. Conclusion Overall evidence from this study indicate that poor quality eggs undergo impairments at both transcription and translation level leading to endoplasmic reticulum and mitochondrial deficiencies. Additional research may be required to expediate the details and the potential of these impairments occurring in different species. Nonetheless, this study will pave the way for future research and will help in acceleration of recent advances in the field of embryonic developmental competence of living organisms.

With declining wild fish populations, farmed Atlantic salmon (Salmo salar) has gained popularity as a source for healthy long-chain highly unsaturated fatty acids (LC-HUFA) including 20:5n-3 and 22:6n-3. However, the introduction of plant-based oil in fish diets has reduced the content of these beneficial LC-HUFA. The capability of biosynthesis of LC-HUFAs depends on fatty acids supplied in diets and the genetic potential residing in the fish. Key proteins involved in LC-HUFA synthesis in salmon include fatty acid desaturases 2 (Fads2). In a recent study we used CRISPR/Cas9 to generate two F0 mutant strains of salmon, 1) Δ6abc/5Mt with mutations in Δ5fads2, Δ6fads2-a, Δ6fads2-b and Δ6fads2-c genes, and 2) Δ6bcMt with mutations in Δ6fads2-b and Δ6fads2-c genes. The CRISPR mutated salmon (crispants) had reduced levels of LC-HUFA and expression of targeted fads2 genes. In present study we apply whole transcriptome analysis on these fads2 crispants. Our purpose is to evaluate the genetic mosaicism in fads2 crispants and the effect these mutations had on other lipid metabolism pathways in fish. Both Δ6abc/5Mt and Δ6bcMt crispants demonstrated high percentage of indels within all intended target genes, though different indel types and percentage were observed between individuals. Skipping of a CRISPR-targeted exon was observed in Δ6fads2-a gene of Δ6abc/5Mt salmon. The Δ6abc/5Mt fish also displayed several disruptive indels which resulted in over 100 differentially expressed genes (DEGs) enriched in lipid metabolism pathways in liver. This includes up-regulation of srebp1 genes as well as genes involved in fatty acid de-novo synthesis, fatty acid β-oxidation and lipogenesis. Both elovl5 and elovl2 genes were not changed, suggesting that the genes were not targeted by Srebp1. The mutation of Δ6bcMt surprisingly resulted in over 3000 DEGs which were enriched in factors encoding genes involved in mRNA regulation and stability.

Despite the key role that sex-determination plays in evolutionary processes, it is still poorly understood in many species. In salmonids, which are the best studied family of fishes, the master sex-determining gene sexually dimorphic on the Y-chromosome (sdY) has been identified. However, sdY displays unexplained discordance to the phenotypic sex, with a variable frequency of phenotypic females being reported as genetic males. Multiple sex determining loci in Atlantic salmon have also been reported, possibly as a result of transposition, suggesting a recent and non-random sex chromosome turnover in this species. We hypothesized the existence of an autosomic pseudocopy of sdY that is transmitted in accordance with Mendelian inheritance. To test this we developed a qPCR methodology to detect the number of sdY copies present in the genome. Based on the observed phenotype/genotype frequencies and linkage analysis among 2025 offspring from 64 pedigree-controlled families of accurately phenotyped Atlantic salmon, we identified both males and females carrying one or two autosomic copies in addition to the Y-specific copy present in males. Copy number frequencies were consistent with Mendelian inheritance. Pseudocopy loci were mapped to different chromosomes evidencing non-random transitions of the sex determining gene in Atlantic salmon and the existence of functional constraints for chromosome turnover.

We describe an emerging initiative - the "Functional Analysis of All Salmonid Genomes" (FAASG), which will leverage the extensive trait diversity that has evolved since a whole genome duplication event in the salmonid ancestor, to develop an integrative understanding of the functional genomic basis of phenotypic variation. The outcomes of FAASG will have diverse applications, ranging from improved understanding of genome evolution, through to improving the efficiency and sustainability of aquaculture production, supporting the future of fundamental and applied research in an iconic fish lineage of major societal importance.