2 ABSTRACT Transmission electron microscopy (TEM) is a scientific research standard for producing nanometer-resolution ultrastructural images of subcellular components within cells and tissues. Mitochondria, endoplasmic reticulum (ER), lysosomes, and autophagosomes are organelles of particular interest to those investigating metabolic disorders. However, there is no clear consensus amongst regarding the best methods for quantifying the features of organelles in TEM images. In this protocol, we propose a standardized approach to accurately measure the morphology of these important subcellular structures using the free program ImageJ, developed by the National Institutes of Health (NIH). Specifically, we detail procedures for obtaining mitochondrial length, width, area, and circularity, in addition to assessing cristae morphology. We further provide methods for measuring interactions between the mitochondria and ER and measuring the length and width of lysosomes and autophagosomes. This standardized method can be used to quantify key features of organelle morphology, allowing investigators to produce accurate and reproducible measurements of organelle structures in their experimental samples. 1 SUMMARY We discuss a standardized method for measuring and quantifying organelle features using transmission electron microscopy and accessing for interactions between subcellular structures; organelles of focus include mitochondria, endoplasmic reticulum, lysosomes, and autophagosomes.

Summary Mitochondrial dynamics (fission, fusion, and the formation of nanotunnels) and morphology are very sensitive to the cellular environment. Mitochondria may be adversely affected by oxidative stress, changes in calcium levels, and hypoxia. Investigating the precise relationship between organelle structure and function requires methods that can adequately preserve mitochondria while providing accurate, quantitative measurements of morphological attributes. Here, we demonstrate a practical approach for preserving and measuring fine structural changes using two-dimensional, high-resolution electron micrographs. This approach is further applicable for three-dimensional volume renderings, obtained using serial block-face and focused ion beam-scanning electron microscopy, highlighting the specific advantages of these techniques. Additionally, this study defines a set of quantifiable metrics that can be applied to measure mitochondrial architecture and other organellar structures. Finally, we validated specimen preparation methods that avoid the introduction of morphological artifacts that may interfere with mitochondrial appearance and do not require whole-animal perfusion.

ABSTRACT With sparse treatment options, cardiac disease remains a significant cause of death among humans. As a person ages, mitochondria break down and the heart becomes less efficient. Heart failure is linked to many mitochondria-associated processes, including endoplasmic reticulum stress, mitochondrial bioenergetics, insulin signaling, autophagy, and oxidative stress. The roles of key mitochondrial complexes that dictate the ultrastructure, such as the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS), in aging cardiac muscle are poorly understood. To better understand the cause of age-related alteration in mitochondrial structure in cardiac muscle, we used transmission electron microscopy (TEM) and serial block facing-scanning electron microscopy (SBF-SEM) to quantitatively analyze the 3D networks in cardiac muscle samples of male mice at aging intervals of 3 months, 1 year, and 2 years. Here, we present the loss of cristae morphology, the inner folds of the mitochondria, across age. In conjunction with this, the 3D volume of mitochondria decreased. These findings mimicked observed phenotypes in murine cardiac fibroblasts with CRISPR/Cas9 knockout of Mitofilin, Chchd3, Chchd6 (some members of the MICOS complex), and Opa1 , which showed poorer oxidative consumption rate and mitochondria with decreased mitochondrial length and volume. In combination, these data show the need to explore if loss of the MICOS complex in the heart may be involved in age-associated mitochondrial and cristae structural changes.

Abstract Many interconnected degradation machineries including autophagosomes, lysosomes, and endosomes work in tandem to conduct autophagy, an intracellular degradation system that is crucial for cellular homeostasis. Altered autophagy contributes to the pathophysiology of various diseases, including cancers and metabolic diseases. Although many studies have investigated autophagy to elucidate disease pathogenesis, identification of specific components of the autophagy machinery has been challenging. The goal of this paper is to describe an approach to reproducibly identify and distinguish subcellular structures involved in macro autophagy. We provide methods that help avoid common pitfalls, including a detailed explanation for distinguishing lysosomes and lipid droplets and discuss differences between autophagosomes and inclusion bodies. These methods are based on using transmission electron microscopy (TEM), capable of generating nanometer-scale micrographs of cellular degradation components in a fixed sample. We also utilize serial block face-scanning electron microscopy (SBF-SEM) to offer a protocol for visualizing 3D morphology of degradation machinery. In addition to TEM and 3D reconstruction, we discuss other imaging techniques, such as immunofluorescence and immunogold labeling that can be utilized to reliably and accurately classify cellular organelles. Our results show how these methods may be used to accurately quantify the cellular degradation machinery under various conditions, such as treatment with the endoplasmic reticulum stressor thapsigargin or ablation of the dynamin-related protein 1.

Summary Mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) contact sites (MERCs) are protein- and lipid-enriched hubs that mediate interorganellar communication by contributing to the dynamic transfer of Ca 2+ , lipid, and other metabolites between these organelles. Defective MERCs are associated with cellular oxidative stress, neurodegenerative disease, and cardiac and skeletal muscle pathology via mechanisms that are poorly understood. We previously demonstrated that skeletal muscle-specific knockdown (KD) of the mitochondrial fusion mediator optic atrophy 1 (OPA1) induced ER stress and correlated with an induction of Mitofusin-2, a known MERC protein. In the present study, we tested the hypothesis that Opa1 downregulation in skeletal muscle cells alters MERC formation by evaluating multiple myocyte systems, including from mice and Drosophila , and in primary myotubes. Our results revealed that OPA1 deficiency induced tighter and more frequent MERCs in concert with a greater abundance of MERC proteins involved in calcium exchange. Additionally, loss of OPA1 increased the expression of activating transcription factor 4 (ATF4), an integrated stress response (ISR) pathway effector. Reducing Atf4 expression prevented the OPA1-loss-induced tightening of MERC structures. OPA1 reduction was associated with decreased mitochondrial and sarcoplasmic reticulum, a specialized form of ER, calcium, which was reversed following ATF4 repression. These data suggest that mitochondrial stress, induced by OPA1 deficiency, regulates skeletal muscle MERC formation in an ATF4-dependent manner.

ABSTRACT Background During aging, muscle gradually undergoes loss of function including sarcopenia, losing mass, strength, endurance, and oxidative capacity. While mitochondrial aging is associated with decreased mitochondrial capacity, the genes associated with morphological changes in mitochondria during aging still require further elucidation. Furthermore, it is not completely understood how 3D mitochondrial structures are altered during aging in skeletal muscle and cardiac tissues. Methods We measured changes in mitochondrial morphology and mitochondrial complexity during the aging of murine gastrocnemius, soleus, and cardiac tissues using serial block face- scanning electron microscopy and 3D reconstruction. Lipidomic and metabolomic analysis elucidated concomitant changes associated with aging. We also used qPCR, transmission electron microscopy quantification, Seahorse Analyzer, and metabolomics to evaluate changes in mitochondria morphology and function upon loss of the MICOS complex. Results We identified significant changes in 3D mitochondrial size and network configuration in murine gastrocnemius, soleus, and cardiac tissue during aging. These changes were concomitant with loss of mitochondria contact site and cristae organizing system (MICOS) gene expression during aging. Mitochondrial morphology was similar between aged mice and young mice. We show an age-related loss of the MICOS complex (Chchd3, chchd6, and Mitofilin) while their knockout results in alterations in mitochondrial morphology. Given the critical role of mitochondria in maintaining cellular metabolism, we perform cellular metabolic profiling of young and aged tissues. Metabolomics and lipidomics showed profound alterations, including in membrane integrity, that support our observations of age-related changes in these muscle tissues. Discussion In tandem, our data suggest a relationship between the MICOS complex and aging, which could be linked to disease states with further 3D reconstruction studies. Our study highlights the importance of understanding tissue-dependent 3D mitochondrial phenotypical changes which occur across aging with evolutionary conservation between Drosophila and murine models. Graphical Abstract

Abstract Mentoring success is derived from active and respectful listening and the willingness to learn and accept opportunities for personal growth. Mentoring shapes every trainee and their career path in science, technology, engineering, and mathematics (STEM). Productive mentoring relationships cultivate rapport, stimulate moments of introspection, and provide constructive feedback. Effective mentoring in STEM allows trainees, especially underrepresented minorities (URMs), to flourish in welcoming and supportive environments. However, URM trainees often experience inadequate mentoring due to their mentor’s inexperience with URM groups, poor mentorship training, or a lack of understanding of their mentee’s journey. To promote diversity, equity, and inclusion in STEM education and research, it is essential for mentors and mentees to work together with creativity, authenticity, and networking. In this workshop, we will focus on mentees’ perspective on how mentors can enhance their training, professional and career development, and improve their focus. We analyzed data on feedback obtained from students interested in pursuing graduate education who attended a recent workshop. Our results show that despite low initial expectations for the workshop, many students were satisfied with the knowledge they learned. The future of increasing the URM representation in STEM lies in providing adequate community support and mentorship throughout the careers of URM professionals.

Despite clinical and scientific advancements, heart failure is the major cause of morbidity and mortality worldwide. Both mitochondrial dysfunction and inflammation contribute to the development and progression of heart failure. Although inflammation is crucial to reparative healing following acute cardiomyocyte injury, chronic inflammation damages the heart, impairs function, and decreases cardiac output. Mitochondria, which comprise one third of cardiomyocyte volume, may prove a potential therapeutic target for heart failure. Known primarily for energy production, mitochondria are also involved in other processes including calcium homeostasis and the regulation of cellular apoptosis. Mitochondrial function is closely related to morphology, which alters through mitochondrial dynamics, thus ensuring that the energy needs of the cell are met. However, in heart failure, changes in substrate use lead to mitochondrial dysfunction and impaired myocyte function. This review discusses mitochondrial and cristae dynamics, including the role of the mitochondria contact site and cristae organizing system complex in mitochondrial ultrastructure changes. Additionally, this review covers the role of mitochondria-endoplasmic reticulum contact sites, mitochondrial communication via nanotunnels, and altered metabolite production during heart failure. We highlight these often-neglected factors and promising clinical mitochondrial targets for heart failure.

Abstract Many studies in mice have demonstrated that cardiac-specific innate immune signaling pathways can be reprogrammed to modulate inflammation in response to myocardial injury and improve outcomes. While the echocardiography standard parameters of left ventricular (LV) ejection fraction, fractional shortening, and end-diastolic diameter, and others, are used to assess cardiac function, their dependency on loading conditions somewhat limit their utility in completely reflecting the contractile function and global cardiovascular efficiency of the heart. A true measure of global cardiovascular efficiency should include of the interaction between the ventricle and the aorta (ventriculo-vascular coupling, VVC) as well as measures of aortic impedance and pulse wave velocity. We measured cardiac Doppler velocities, blood pressures, along with VVC, aortic impedance, and pulse wave velocity to evaluate global cardiac function in mouse model of cardiac-restricted low levels TRAF2 overexpression that conferred cytoprotection in the heart. While previous studies reported that response to myocardial infraction and reperfusion was improved in the TRAF2 overexpressed mice, we found that TRAF2 mice had significantly lower cardiac systolic velocities and accelerations, diastolic atrial velocity, lower aortic pressures and rate-pressure product, lower LV contractility and relaxation, and lower stroke work when compared to littermate control mice. Also, we found significantly longer aortic ejection time, isovolumic contraction and relaxation times, and significantly higher mitral early/atrial ratio, myocardial performance index, and ventricular vascular coupling in the TRAF2 overexpression mice compared to their littermate controls. We found no significant differences in the aortic impedance and pulse wave velocity. While the reported tolerance to ischemic insults in TRAF2 overexpression mice may suggest enhanced cardiac reserve, our results indicate a diminished cardiac function in these mice.

Abstract The physical characteristics of brown adipose tissue (BAT) are defined by the presence of multilocular lipid droplets (LDs) within the brown adipocytes and a high abundance of iron‐containing mitochondria, which give it its characteristic color. Normal mitochondrial function is, in part, regulated by organelle‐to‐organelle contacts. For example, the contact sites that mediate mitochondria–LD interactions are thought to have various physiological roles, such as the synthesis and metabolism of lipids. Aging is associated with mitochondrial dysfunction, and previous studies show that there are changes in mitochondrial structure and the proteins that modulate organelle contact sites. However, how mitochondria–LD interactions change with aging has yet to be fully clarified. Therefore, we sought to define age‐related changes in LD morphology and mitochondria–lipid interactions in BAT. We examined the three‐dimensional morphology of mitochondria and LDs in young (3‐month) and aged (2‐year) murine BAT using serial block face‐scanning electron microscopy and the Amira program for segmentation, analysis, and quantification. Our analyses showed reductions in LD volume, area, and perimeter in aged samples in comparison to young samples. Additionally, we observed changes in LD appearance and type in aged samples compared to young samples. Notably, we found differences in mitochondrial interactions with LDs, which could implicate that these contacts may be important for energetics in aging. Upon further investigation, we also found changes in mitochondrial and cristae structure for the mitochondria interacting with LDs. Overall, these data define the nature of LD morphology and organelle–organelle contacts during aging and provide insight into LD contact site changes that interconnect biogerontology with mitochondrial function, metabolism, and bioactivity in aged BAT.