ABSTRACT Objectives This study aimed to measure the variability in carbapenem susceptibility conferred by different OxaAb variants, characterise the molecular evolution of oxaAb and elucidate the contribution of OxaAb and other possible carbapenem resistance factors in the clinical isolates using WGS and LC-MS/MS. Methods Disc susceptibility and MIC broth microdilution tests were performed on ten clinical A. baumannii isolates and interpreted according to CLSI guidelines. Imipenem and meropenem MICs were evaluated for all oxaAb variants cloned into susceptible A. baumannii CIP70.10 and increased adeABC efflux pump gene expression BM4547 backgrounds, with and without their natural promoters. Molecular evolution analysis of the oxaAb variants was performed using FastTree and SplitsTree4. Resistance determinants were studied in the clinical isolates using WGS and LC-MS/MS analysis. Results OxaAb(82), OxaAb(83), OxaAb(107), and OxaAb(110) carrying I129L and L167V substitutions increased carbapenem MICs when transferred into susceptible A. baumannii backgrounds without an upstream IS element. Carbapenem resistance was conferred with the addition of their natural upstream IS Aba1 promoter. LC-MS/MS analysis on the original clinical isolates showed no differences in expression levels of proteins commonly associated with carbapenem resistance. Conclusions IS Aba1 -driven overexpression of OxaAb variants with substitutions I129L and L167V confers carbapenem resistance with no need for additional resistance mechanisms.

ABSTRACT The emergence of antimicrobial resistance represents a significant health and economic challenge worldwide. The slow pace of antibacterial discovery necessitates strategies for optimal use of existing agents, including effective diagnostics able to drive informed prescribing; and development of alternative therapeutic strategies that go beyond traditional small-molecule approaches. Thus, the development of novel probes able to target bacteria for detection and killing, and that can pave the way to effective theranostic strategies, is of great importance. Here we demonstrate that metal-free green-emitting fluorescent carbon dots (FCDs) synthesized from glucosamine HCl and m -phenylenediamine, and featuring 2,5-deoxyfructosazine on a robust amorphous core, can label both Gram-positive ( Staphylococcus aureus ) and Gram-negative ( Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ) bacterial pathogens within 10 minutes of exposure. Moreover, effective killing of Gram-positive and -negative bacteria can be induced by combining FCD treatment with irradiation by LED light in the visible range. Cell-based, electron microscopy and Tandem Mass Tag (TMT) proteomic experiments indicate that FCD administration in combination with LED exposure gives rise to local heating, ROS production, and membrane- and DNA-damage, suggesting multiple routes to FCD-mediated bacterial killing. Our data identify FCDs as materials that combine facile synthesis from low-cost precursors with labelling and light-dependent killing of clinically important bacterial species, and that thus warrant further exploration as the potential bases for novel theranostics.

Abstract Meropenem is a clinically important antibacterial reserved for treatment of multi-resistant infections. In meropenem-resistant bacteria of the family Enterobacteriales, NDM-1 is considerably more common than IMP-1, despite both metallo-β-lactamases (MBLs) hydrolysing meropenem with almost identical kinetics. We show that bla NDM-1 consistently confers meropenem resistance in wild-type Enterobacteriales, but bla IMP-1 does not. The reason is higher bla NDM-1 expression because of its stronger promoter. However, the cost of meropenem resistance is reduced fitness of bla NDM-1 positive Enterobacteriales because of amino acid starvation. In parallel, from a clinical case, we identified multiple Enterobacter spp. isolates carrying a plasmid-encoded bla NDM-1 having a modified promoter region. This modification lowered MBL production to a level associated with zero fitness cost but, consequently, the isolates were not meropenem resistant. However, we identified a Klebsiella pneumoniae isolate from this same clinical case carrying the same bla NDM-1 plasmid. This isolate was meropenem resistant despite low-level NDM-1 production because of a ramR mutation, reducing envelope permeability. Overall, therefore, we show how the resistance/fitness trade-off for MBL carriage can be resolved. The result is sporadic emergence of meropenem resistance in a clinical setting.

Abstract With the rise in bacterial antimicrobial resistance (AMR) and decline in antibiotic discovery, global healthcare is at a point of jeopardy. There is great need for the development of novel antimicrobials that target bacteria that have become resistant to our existing antibiotics, in particular Gram-negative species such as Escherichia coli which is responsible for opportunistic infections of already compromised patients. Here we demonstrate that a novel pyridinium-functionalised azobenzene scaffold L20 , identified as a candidate ligand able target G-quadruplex (G4) structures in bacterial genomes/transcriptomes, shows promising antibacterial activity (MIC values ≤ 4 µg/ml) against multi-drug resistant E. coli . Tandem Mass Tag (TMT) proteomics applied to cultures of the E. coli type strain ATCC 25922 treated with sub-lethal concentrations of L20 , identified seven G4-containing sequences as potential targets for L20 . FRET (fluorescence resonance energy transfer) stabilisation assays indicate L20 binds these selected sequences with variable and moderate affinity, in contrast to two comparator G4 ligands (stiff-stilbene L5 and pyridostatin ( PDS )) that better stabilise G4 structures but exhibit a lower antimicrobial activity. However, proteomic experiments also reveal that, alongside its superior antibacterial activity, L20 treatment influences expression levels of more G4-associated proteins than either L5 or PDS, and upregulates multiple essential proteins involved in translation. These findings identify strategies discovering potential G4 ligands as approaches that can lead to antibacterial candidates active against priority targets such as multi-drug resistant E. coli , and that targeting G4 sequences, and ligands such as L20 , warrant further exploration as potential novel therapeutics with G4-mediated modes of action.

The mobile antibiotic resistance gene blaIMP-1 is clinically important and has a synonymous AAA:AAG lysine codon usage bias of 73:27. This bias is like that seen in experimentally determined highly expressed genes in Escherichia coli and Acinetobacter baumanii, but quite different from that seen in Pseudomonas aeruginosa (26:74 AAA:AAG). Here we show that, paradoxically, shifting the AAA:AAG lysine codon bias to 8:92 in blaIMP-1 expressed from a natural promoter results in significantly more IMP-1 production in all three species. Sequential site directed mutagenesis revealed that increased IMP-1 production occurs following removal of an AAA,AAA double lysine codon and that otherwise, lysine codon usage had no observable impact on IMP-1 production. We conclude that ribosomal slippage at this poly-adenosine region reduces efficient translation of IMP-1 and that punctuating the region with guanine reduces ribosomal slippage and increases IMP-1 production.

Mutants with enhanced growth in the presence of antibiotics but where the antibiotic's minimum inhibitory concentration does not change, are difficult to identify in mixed populations because they are not amenable to selection. Here we report that activatory mutations in the CreC signal sensor enhance growth of Escherichia coli in the presence of cefoxitin, cefotaxime and meropenem without increasing their minimum inhibitory concentrations. Enhanced growth is dependent on overproduction of the inner-membrane cre-regulon protein CreD.

Abstract There is significant interest in the possibility of predicting antibacterial drug susceptibility directly though the analysis of bacterial DNA or protein. We report the use of Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii transformants to define baseline predictive rules for the β- lactam susceptibility profiles of β-lactamase positive clinical isolates. We then deployed a robust and reproducible shotgun proteomics methodology to identify β-lactamase positivity and predict β-lactam susceptibility by reference to our baseline predictive rules both in cultured bacteria and in extracts of culture-positive blood. Proteomics and whole genome sequencing then allowed us to characterise K. pneumoniae and P. aeruginosa isolates that differed from the expected β-lactam susceptibility profile, iteratively expanding our predictive rules. Proteomics added considerable value over and above the information generated by whole genome sequencing, allowing for gene expression, not just gene presence to be considered. Specifically, in K. pneumoniae , we identified key differences between acrR and ramR regulatory mutations and compared the effects of OmpK36 Aspartate-Threonine or Glycine-Aspartate dipeptide porin insertions on susceptibility to cefepime and carbapenems. In P. aeruginosa , we identified differences in the gene expression effects of mexR versus nalC mutations and related these to differences in β-lactam MICs against isolates hyper-producing AmpC β-lactamase and or producing a metallo-β-lactamase.

Fluoroquinolone resistance in bacteria is multifactorial, involving target site mutations, reductions in fluoroquinolone entry due to reduced porin production, increased fluoroquinolone efflux, enzymes that modify fluoroquinolones, and Qnr, a DNA mimic that protects the drug target from fluoroquinolone binding. Here we report a comprehensive analysis using transformation and in vitro mutant selection, of the relative importance of each of these mechanisms in fluoroquinolone resistance and non-susceptibility, using Klebsiella pneumoniae, one of the most clinically important multi-drug resistant bacterial species known, as a model system. Our improved biological understanding was then used to generate rules that could be predict fluoroquinolone susceptibility in K. pneumoniae clinical isolates. Key to the success of this predictive process was the use of liquid chromatography tandem mass spectrometry to measure the abundance of proteins in extracts of cultured bacteria, identifying which sequence variants seen in the whole genome sequence data were functionally important in the context of fluoroquinolone susceptibility.

Amikacin and piperacillin/tazobactam are frequent antibiotic choices to treat bloodstream infection, which is commonly fatal and most often caused by bacteria from the family Enterobacterales. Here we show that two gene cassettes located side-by-side in and ancestral integron similar to In37 have been "harvested" by insertion sequence IS26 as a transposon that is already globally disseminated among the Enterobacterales. This transposon encodes the enzymes AAC(69)-Ib-cr and OXA-1, reported, respectively, as amikacin and piperacillin/tazobactam resistance mechanisms. However, by studying bloodstream infection isolates from 769 patients from, three hospitals serving a population of 1.5 million people in South West England, we show that increased enzyme production due to mutation in an IS26/In37-derived hybrid promoter or, more commonly, transposon copy number amplification is required to simultaneously remove these two key therapeutic options; in many cases leaving only the last-resort antibiotic, meropenem. These findings may help improve the accuracy of predicting piperacillin/tazobactam treatment failure, allowing stratification of patients to receive meropenem or piperacillin/tazobactam, which may improve outcome and slow the emergence of meropenem resistance.

OBJECTIVES: In Klebsiella pneumoniae, overproduction of RamA results in reduced envelope permeability and reduced antimicrobial susceptibility but clinically relevant resistance is rarely observed. Here we have tested whether RamA over-production can enhance acquired β-lactam resistance mechanisms in K. pneumoniae and have defined the envelope protein abundance changes seen upon RamA overproduction during growth in low and high osmolarity media. METHODS: Envelope permeability was estimated using a fluorescent dye accumulation assay. Antibiotic susceptibility was measured using disc testing. Total envelope protein production was quantified using LC-MS/MS proteomics and transcript levels quantified by Real Time RT-PCR. RESULTS: RamA overproduction enhanced β-lactamase mediated β-lactam resistance, in some cases dramatically, without altering β-lactamase production. It increased production of efflux pumps and decreased OmpK35 porin production, though micF over-expression showed that OmpK35 reduction has little impact on envelope permeability. A survey of K. pneumoniae bloodstream isolates revealed ramA hyperexpression in 3 out of 4 carbapenemase producers, 1/21 CTX-M producers and 2/19 strains not carrying CTX-M or carbapenemases. CONCLUSIONS: Whilst RamA is not a key mediator of antibiotic resistance in K. pneumoniae on its own, it is potentially important for enhancing the spectrum of acquired β-lactamase mediated β-lactam resistance. LC-MS/MS proteomics analysis has revealed that this enhancement is achieved predominantly through activation of efflux pump production.