Abstract Objectives Third-generation cephalosporin-resistant Escherichia coli from community-acquired urinary tract infections (UTI) have been increasingly reported worldwide. In this study we sought to determine and characterise the mechanisms of cefotaxime-resistance (CTX-R) employed by urinary E. coli obtained from primary care over a 12-month period, in Bristol and surrounding counties in the South West of England. Methods Cephalexin resistant (Ceph-R) E. coli isolates were identified directly from general practice (GP) referred urine samples using disc susceptibility testing as per standard diagnostic procedures. CTX-R was determined by subsequent plating onto MIC breakpoint plates. β-Lactamase genes were detected by PCR. Whole Genome Sequencing (WGS) was performed on 225 urinary isolates and analyses were performed using the Centre for Genomic Epidemiology platform. Patient information provided by the referring GPs was reviewed. Results During the study period, Ceph-R E. coli (n=900) were obtained directly from urines from 146 GPs. Seventy-percent (626/900) of isolates were CTX-R. WGS of 225 non-duplicate isolates identified that the most common mechanism of CTX-R was bla CTX-M carriage (185/225; 82.2%), predominantly bla CTX-M-15 (114/185; 61.6%), followed by carriage of plasmid mediated AmpCs (pAmpCs) (17/225; 7.6%), ESBL bla SHV variants (6/225; 2.7%), AmpC hyperproduction (13/225; 5.8%), or a combination of both bla CTX-M and pAmpC carriage (4/225; 1.8%). Forty-four sequence types (STs) were identified with ST131 representing 101/225 (45.0%) of sequenced isolates, within which the bla CTX-M-15 -positive clade C2 was dominant (54/101; 53.5%). Ciprofloxacin-resistance (CIP-R) was observed in 128/225 (56.9%) of sequenced CTX-R isolates – predominantly associated with fluoroquinolone-resistant clones ST131 and ST1193. Conclusions Most Ceph-R urinary E. coli s were CTX-R, predominantly caused by bla CTX-M carriage. There was a clear correlation between CTX-R and CIP-R, largely attributable to the dominance of the high-risk pandemic clones, ST131 and ST1193 in this study. This localised epidemiological data provides greater resolution than regional data and can be valuable for informing treatment choices in the primary care setting.

Abstract Meropenem is a clinically important antibacterial reserved for treatment of multi-resistant infections. In meropenem-resistant bacteria of the family Enterobacteriales, NDM-1 is considerably more common than IMP-1, despite both metallo-β-lactamases (MBLs) hydrolysing meropenem with almost identical kinetics. We show that bla NDM-1 consistently confers meropenem resistance in wild-type Enterobacteriales, but bla IMP-1 does not. The reason is higher bla NDM-1 expression because of its stronger promoter. However, the cost of meropenem resistance is reduced fitness of bla NDM-1 positive Enterobacteriales because of amino acid starvation. In parallel, from a clinical case, we identified multiple Enterobacter spp. isolates carrying a plasmid-encoded bla NDM-1 having a modified promoter region. This modification lowered MBL production to a level associated with zero fitness cost but, consequently, the isolates were not meropenem resistant. However, we identified a Klebsiella pneumoniae isolate from this same clinical case carrying the same bla NDM-1 plasmid. This isolate was meropenem resistant despite low-level NDM-1 production because of a ramR mutation, reducing envelope permeability. Overall, therefore, we show how the resistance/fitness trade-off for MBL carriage can be resolved. The result is sporadic emergence of meropenem resistance in a clinical setting.

Synopsis Background Our primary aim was to test whether cattle-associated fluoroquinolone-resistant (FQ-R) Escherichia coli found on dairy farms were a significant cause of bacteriuria in humans living in the same 50 × 50 km geographical region located in South West England. Another aim was to identify risk factors for the presence of FQ-R E. coli on dairy farms. Methods FQ-R E. coli were isolated during 2017-18 from 42 dairy farms and from community urine samples. Forty-two cattle and 489 human urinary isolates were subjected to WGS, allowing phylogenetic comparisons. Risk factors were identified using a Bayesian regularisation approach. Results Of 489 FQ-R human isolates, 255 were also 3 rd generation cephalosporin-resistant (3GC-R), with strong genetic linkage between aac(6’)Ib-cr and bla CTX-M-15 . We identified possible farm-to-human sharing for pairs of ST744 and ST162 isolates, but core genome SNP distances (71 and 63, respectively) were smaller in pairs of ST744 and ST162 isolates from different farms (7 and 3 SNPs, respectively). Total farm fluoroquinolone use showed a positive association with the odds of isolating FQ-R E. coli while total dry cow therapy use showed a negative association. Conclusions This work suggests that FQ-R E. coli found on dairy farms have a limited impact on community bacteriuria within the local human population, however, this appears greater than observed for 3GC-R E. coli when studied in parallel. Reducing fluoroquinolone use may reduce the on-farm prevalence of FQ-R E. coli , and this reduction may be greater when dry cow therapy is targeted to the ecology of resistant E. coli on the farm.

In vitro antibacterial susceptibility testing informs clinical decision making concerning antibacterial therapeutics. Predicting, in a timely manner, which bacterial infection will respond to treatment by a given antibacterial drug reduces morbidity, mortality, and healthcare costs. It also allows prudent antibacterial use, because clinicians can focus on the least broad-spectrum agent suitable for each patient. Existing susceptibly testing methodologies rely on growth of bacteria in the presence of an antibacterial drug. There is significant interest in the possibility of predicting antibacterial drug susceptibility directly though the analysis of bacterial DNA or protein, because this may lead to more rapid susceptibility testing directly from clinical samples. Here we report a robust and tractable methodology that allows measurement of the abundance of key proteins responsible for antibacterial drug resistance within samples of 1 microgram of total bacterial protein. The method allowed correct prediction of beta-lactam susceptibility in clinical isolates from four key bacterial species and added considerable value over and above the information generated by whole genome sequencing, allowing for gene expression, not just gene presence to be considered, which is key when considering the complex interplays of multiple mechanisms of resistance.

Fluoroquinolone resistance in bacteria is multifactorial, involving target site mutations, reductions in fluoroquinolone entry due to reduced porin production, increased fluoroquinolone efflux, enzymes that modify fluoroquinolones, and Qnr, a DNA mimic that protects the drug target from fluoroquinolone binding. Here we report a comprehensive analysis using transformation and in vitro mutant selection, of the relative importance of each of these mechanisms in fluoroquinolone resistance and non-susceptibility, using Klebsiella pneumoniae, one of the most clinically important multi-drug resistant bacterial species known, as a model system. Our improved biological understanding was then used to generate rules that could be predict fluoroquinolone susceptibility in K. pneumoniae clinical isolates. Key to the success of this predictive process was the use of liquid chromatography tandem mass spectrometry to measure the abundance of proteins in extracts of cultured bacteria, identifying which sequence variants seen in the whole genome sequence data were functionally important in the context of fluoroquinolone susceptibility.

Abstract There is significant interest in the possibility of predicting antibacterial drug susceptibility directly though the analysis of bacterial DNA or protein. We report the use of Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii transformants to define baseline predictive rules for the β- lactam susceptibility profiles of β-lactamase positive clinical isolates. We then deployed a robust and reproducible shotgun proteomics methodology to identify β-lactamase positivity and predict β-lactam susceptibility by reference to our baseline predictive rules both in cultured bacteria and in extracts of culture-positive blood. Proteomics and whole genome sequencing then allowed us to characterise K. pneumoniae and P. aeruginosa isolates that differed from the expected β-lactam susceptibility profile, iteratively expanding our predictive rules. Proteomics added considerable value over and above the information generated by whole genome sequencing, allowing for gene expression, not just gene presence to be considered. Specifically, in K. pneumoniae , we identified key differences between acrR and ramR regulatory mutations and compared the effects of OmpK36 Aspartate-Threonine or Glycine-Aspartate dipeptide porin insertions on susceptibility to cefepime and carbapenems. In P. aeruginosa , we identified differences in the gene expression effects of mexR versus nalC mutations and related these to differences in β-lactam MICs against isolates hyper-producing AmpC β-lactamase and or producing a metallo-β-lactamase.