Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) offers new possibilities to address biological and medical questions. However, systematic comparisons of the performance of diverse scRNA-seq protocols are lacking. We generated data from 583 mouse embryonic stem cells to evaluate six prominent scRNA-seq methods: CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-seq, Smart-seq, and Smart-seq2. While Smart-seq2 detected the most genes per cell and across cells, CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, and SCRB-seq quantified mRNA levels with less amplification noise due to the use of unique molecular identifiers (UMIs). Power simulations at different sequencing depths showed that Drop-seq is more cost-efficient for transcriptome quantification of large numbers of cells, while MARS-seq, SCRB-seq, and Smart-seq2 are more efficient when analyzing fewer cells. Our quantitative comparison offers the basis for an informed choice among six prominent scRNA-seq methods, and it provides a framework for benchmarking further improvements of scRNA-seq protocols.

Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) experiments typically analyze hundreds or thousands of cells after amplification of the cDNA. The high throughput is made possible by the early introduction of sample-specific bar codes (BCs), and the amplification bias is alleviated by unique molecular identifiers (UMIs). Thus, the ideal analysis pipeline for scRNA-seq data needs to efficiently tabulate reads according to both BC and UMI. zUMIs is a pipeline that can handle both known and random BCs and also efficiently collapse UMIs, either just for exon mapping reads or for both exon and intron mapping reads. If BC annotation is missing, zUMIs can accurately detect intact cells from the distribution of sequencing reads. Another unique feature of zUMIs is the adaptive downsampling function that facilitates dealing with hugely varying library sizes but also allows the user to evaluate whether the library has been sequenced to saturation. To illustrate the utility of zUMIs, we analyzed a single-nucleus RNA-seq dataset and show that more than 35% of all reads map to introns. Also, we show that these intronic reads are informative about expression levels, significantly increasing the number of detected genes and improving the cluster resolution. zUMIs flexibility makes if possible to accommodate data generated with any of the major scRNA-seq protocols that use BCs and UMIs and is the most feature-rich, fast, and user-friendly pipeline to process such scRNA-seq data.

Abstract Power analysis is essential to optimize the design of RNA-seq experiments and to assess and compare the power to detect differentially expressed genes in RNA-seq data. PowsimR is a flexible tool to simulate and evaluate differential expression from bulk and especially single-cell RNA-seq data making it suitable for a priori and posterior power analyses.

Abstract Background Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) offers exciting possibilities to address biological and medical questions, but a systematic comparison of recently developed protocols is still lacking. Results We generated data from 447 mouse embryonic stem cells using Drop-seq, SCRB-seq, Smart-seq (on Fluidigm C1) and Smart-seq2 and analyzed existing data from 35 mouse embryonic stem cells prepared with CEL-seq. We find that Smart-seq2 is the most sensitive method as it detects the most genes per cell and across cells. However, it shows more amplification noise than CEL-seq, Drop-seq and SCRB-seq as it cannot use unique molecular identifiers (UMIs). We use simulations to model how the observed combinations of sensitivity and amplification noise affects detection of differentially expressed genes and find that SCRB-seq reaches 80% power with the fewest number of cells. When considering cost-efficiency at different sequencing depths at 80% power, we find that Drop-seq is preferable when quantifying transcriptomes of a large numbers of cells with low sequencing depth, SCRB-seq is preferable when quantifying transcriptomes of fewer cells and Smart-seq2 is preferable when annotating and/or quantifying transcriptomes of fewer cells as long one can use in-house produced transposase. Conclusions Our analyses allows an informed choice among five prominent scRNA-seq protocols and provides a solid framework for benchmarking future improvements in scRNA-seq methodologies.

Abstract With the advent of Next Generation Sequencing, RNA-sequencing (RNA-seq) has become the major method for quantitative gene expression analysis. Reducing library costs by early barcoding has propelled single-cell RNA-seq, but has not yet caught on for bulk RNA-seq. Here, we optimized and validated a bulk RNA-seq method we call prime-seq. We show that with respect to library complexity, measurement accuracy, and statistical power it performs equivalent to TruSeq, a standard bulk RNA-seq method, but is four-fold more cost-efficient due to almost 50-fold cheaper library costs. We also validate a direct RNA isolation step that further improves cost and time-efficiency, show that intronic reads are derived from RNA, validate that prime-seq performs optimal with only 1,000 cells as input, and calculate that prime-seq is the most cost-efficient bulk RNA-seq method currently available. We discuss why many labs would profit from a cost-efficient early barcoding RNA-seq protocol and argue that prime-seq is well suited for setting up such a protocol as it is well validated, well documented, and requires no specialized equipment.

Brain size and cortical folding have increased and decreased recurrently during mammalian evolution. Identifying genetic elements whose sequence or functional properties co-evolve with these traits can provide unique information on evolutionary and developmental mechanisms. A good candidate for such a comparative approach is TRNP1, as it can control proliferation of neural progenitors in mice and ferrets. Here, we investigate the contribution of both regulatory and coding sequences of TRNP1 to brain size and cortical folding in over 30 mammals. We find that the rate of TRNP1 protein evolution (ω) significantly correlates with brain size, slightly less with cortical folding and much less with body size. This brain correlation is stronger than for >95% of random control proteins. This co-evolution is likely affecting TRNP1 activity, as we find that TRNP1 from species with larger brains and more cortical folding induce higher proliferation rates in neural stem cells. Furthermore, we compare the activity of putative cis-regulatory elements (CREs) of TRNP1 in a massively parallel reporter assay (MPRA) and identify one CRE that co-evolves with cortical folding in Old World Monkeys and Apes. Our analyses indicate that coding and regulatory changes that increased TRNP1 activity were positively selected either as a cause or a consequence of increases in brain size and cortical folding. They also provide an example how phylogenetic approaches can inform biological mechanisms, especially when combined with molecular phenotypes across several species.

Abstract BACKGROUND In droplet-based single-cell and single-nucleus RNA-seq experiments, not all reads associated with one cell barcode originate from the encapsulated cell. Such background noise is attributed to spillage from cell-free ambient RNA or barcode swapping events. Here, we characterize this background noise exemplified by three single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and two single-nucleus RNA-seq (snRNA-seq) replicates of mouse kidney cells. For each experiment, kidney cells from two mouse subspecies were pooled, allowing to identify cross-genotype contaminating molecules and estimate the levels of background noise. RESULTS We find that background noise is highly variable across replicates and individual cells, making up on average 3-35% of the total counts (UMIs) per cell and show that this has a considerable impact on the specificity and detectability of marker genes. In search of the source of background noise, we find that expression profiles of cell-free droplets are very similar to expression profiles of cross-genotype contamination and hence that the majority of background molecules originates from ambient RNA. Finally, we use our genotype-based estimates to evaluate the performance of three methods (CellBender, DecontX, SoupX) that are designed to quantify and remove background noise. We find that CellBender provides the most precise estimates of background noise levels and also yields the highest improvement for marker gene detection. By contrast, clustering and classification of cells are fairly robust towards background noise and only small improvements can be achieved by background removal that may come at the cost of distortions in fine structure. CONCLUSION Our findings help to better understand the extent, sources and impact of background noise in single-cell experiments and provide guidance on how to deal with it.

Genetic and clinical studies of speech and language disorders are providing starting points to unravel underlying neurobiological mechanisms. The gene encoding the transcription factor FOXP2 has been the first example of a gene involved in the development and evolution of this human-specific trait. A number of autosomal-dominant FOXP2 mutations are associated with developmental speech and language deficits indicating that gene dosage plays an important role in the disorder. Comparative genomics studies suggest that two human-specific amino acid substitutions in FOXP2 might have been positively selected during human evolution. A knock-in mouse model carrying these two amino acid changes in the endogenous mouse Foxp2 gene (Foxp2hum/hum) shows profound changes in striatum-dependent behaviour and neurophysiology, supporting a functional role for these changes. However, how this affects Foxp2 expression patterns in different striatal regions and compartments has not been assessed. Here, we characterized Foxp2 protein expression patterns in adult striatal tissue in Foxp2hum/hum mice. Consistent with prior reports in wildtype mice, we find that striatal neurons in Foxp2hum/hum mice and wildtype littermates express Foxp2 in a range from low to high levels. However, we observe a shift towards more cells with higher Foxp2 expression levels in Foxp2hum/hum mice, significantly depending on the striatal region and the compartment. As potential behavioural readout of these shifts in Foxp2 levels across striatal neurons, we employed a morphine sensitization assay. While we did not detect differences in morphine-induced hyperlocomotion during acute treatment, there was an attenuated hyperlocomotion plateau during sensitization in Foxp2hum/hum mice. Taken together, these results suggest that the humanized Foxp2 allele in a mouse background is associated with a shift in striatal Foxp2 protein expression pattern.

Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) has emerged as the central genome-wide method to characterize cellular identities and processes. While performance of scRNA-seq methods is improving, an optimum in terms of sensitivity, cost-efficiency and flexibility has not yet been reached. Among the flexible plate-based methods "Single-Cell RNA-Barcoding and Sequencing" (SCRB-seq) is one of the most sensitive and efficient ones. Based on this protocol, we systematically evaluated experimental conditions such as reverse transcriptases, reaction enhancers and PCR polymerases. We find that adding polyethylene glycol considerably increases sensitivity by enhancing cDNA synthesis. Furthermore, using Terra polymerase increases efficiency due to a more even cDNA amplification that requires less sequencing of libraries. We combined these and other improvements to a new scRNA-seq library protocol we call "molecular crowding SCRB-seq" (mcSCRB-seq), which we show to be the most sensitive and one of the most efficient and flexible scRNA-seq methods to date.

The recent rapid spread of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) methods has created a large variety of experimental and computational pipelines for which best practices have not been established, yet. Here, we use simulations based on five scRNA-seq library protocols in combination with nine realistic differential expression (DE) setups to systematically evaluate three mapping, four imputation, seven normalisation and four differential expression testing approaches resulting in ∼ 3,000 pipelines, allowing us to also assess interactions among pipeline steps. We find that choices of normalisation and library preparation protocols have the biggest impact on scRNA-seq analyses. Specifically, we find that library preparation determines the ability to detect symmetric expression differences, while normalisation dominates pipeline performance in asymmetric DE-setups. Finally, we illustrate the importance of informed choices by showing that a good scRNA-seq pipeline can have the same impact on detecting a biological signal as quadrupling the sample size.