Abstract The etiology of dental caries remains elusive because of our limited understanding of the complex oral microbiomes. The current methodologies have been limited by insufficient depth and breadth of microbial sampling, paucity of data for diseased hosts particularly at the population level, inconsistency of sampled sites and the inability to distinguish the underlying microbial factors. By cross-validating 16S rRNA gene amplicon-based and whole-genome-based deep-sequencing technologies, we report the most in-depth, comprehensive and collaborated view to date of the adult saliva microbiomes in pilot populations of 19 caries-active and 26 healthy human hosts. We found that: first, saliva microbiomes in human population were featured by a vast phylogenetic diversity yet a minimal organismal core; second, caries microbiomes were significantly more variable in community structure whereas the healthy ones were relatively conserved; third, abundance changes of certain taxa such as overabundance of Prevotella Genus distinguished caries microbiota from healthy ones, and furthermore, caries-active and normal individuals carried different arrays of Prevotella species; and finally, no ‘caries-specific’ operational taxonomic units (OTUs) were detected, yet 147 OTUs were ‘caries associated’, that is, differentially distributed yet present in both healthy and caries-active populations. These findings underscored the necessity of species- and strain-level resolution for caries prognosis, and were consistent with the ecological hypothesis where the shifts in community structure, instead of the presence or absence of particular groups of microbes, underlie the cariogenesis.

Abstract During the COVID-19 pandemic, SARS-CoV-2 surveillance efforts integrated genome sequencing of clinical samples to identify emergent viral variants and to support rapid experimental examination of genome-informed vaccine and therapeutic designs. Given the broad range of methods applied to generate new viral genomes, it is critical that consensus and variant calling tools yield consistent results across disparate pipelines. Here we examine the impact of sequencing technologies (Illumina and Oxford Nanopore) and 7 different downstream bioinformatic protocols on SARS-CoV-2 variant calling as part of the NIH Accelerating COVID-19 Therapeutic Interventions and Vaccines (ACTIV) Tracking Resistance and Coronavirus Evolution (TRACE) initiative, a public-private partnership established to address the COVID-19 outbreak. Our results indicate that bioinformatic workflows can yield consensus genomes with different single nucleotide polymorphisms, insertions, and/or deletions even when using the same raw sequence input datasets. We introduce the use of a specific suite of parameters and protocols that greatly improves the agreement among pipelines developed by diverse organizations. Such consistency among bioinformatic pipelines is fundamental to SARS-CoV-2 and future pathogen surveillance efforts. The application of analysis standards is necessary to more accurately document phylogenomic trends and support data-driven public health responses.

ABSTRACT Metagenomics is emerging as an important tool in biosurveillance, public health, and clinical applications. However, ease-of-use for execution and data analysis remains a barrier-of-entry to the adoption of metagenomics in applied health and forensics settings. In addition, these venues often have more stringent requirements for reporting, accuracy, and precision than the traditional ecological research role of the technology. Here, we present PanGIA ( Pan - G enomics for I nfectious A gents), a novel bioinformatics analysis platform for hosting, processing, analyzing, and reporting shotgun metagenomics data of complex samples suspected of containing one or more pathogens. PanGIA was developed to address gaps that often preclude clinicians, medical technicians, forensics personnel, or other non-expert end-users from the routine application of metagenomics for pathogen identification. Though primarily designed to detect pathogenic microorganisms within clinical and environmental metagenomics data, PanGIA also serves as an analytical framework for microbial community profiling and comparative metagenomics. To provide statistical confidence in PanGIA’s taxonomic assignments, the system provides two independent estimations of probability for species and strain level detection. First, PanGIA integrates coverage data with ‘uniqueness’ information mapped across each reference genome for a stand-alone determination of confidence for each query sequence at each taxonomy level. Second, if a negative-control sample is provided, PanGIA compares this sample with a corresponding experimental unknown sample and determines a measure of confidence associated with ‘detection above background’. An integrated graphical user interface allows interactive interrogation and enables users to summarize multiple sample results by confidence score, normalized read abundance, reference genome linear coverage, depth-of-coverage, RPKM, and other metrics to detect specific organisms-of-interest. Comparison testing of the PanGIA algorithm against a number of recent k-mer, read-mapping, and marker-gene based taxonomy classifiers across various real-world datasets with spiked targets shows superior mean positive predictive value, sensitivity, and specificity. PanGIA can process a five million paired-end read dataset in under 1 hour on commodity computational hardware. The source code and documentation are publicly available at https://github.com/LANL-Bioinformatics/PanGIA or https://github.com/mriglobal/PanGIA . The database for PanGIA can be downloaded from ftp://bioinformatics.mriglobal.org/ . The full GUI-based PanGIA analysis environment is available in a Docker container and can be installed from https://hub.docker.com/r/poeli/pangia/ .

Abstract The Antarctic marine ecosystem harbors a wealth of biological and chemical innovation that has risen in concert over millennia since the isolation of the continent and formation of the Antarctic circumpolar current. Scientific inquiry into the novelty of marine natural products produced by Antarctic benthic invertebrates led to the discovery of a bioactive macrolide, palmerolide A, that has specific activity against melanoma and holds considerable promise as an anticancer therapeutic. While this compound was isolated from the Antarctic ascidian Synoicum adareanum , its biosynthesis has since been hypothesized to be microbially mediated, given structural similarities to microbially-produced hybrid non-ribosomal peptide-polyketide macrolides. Here, we describe a metagenome-enabled investigation aimed at identifying the biosynthetic gene cluster (BGC) and palmerolide A-producing organism. A 74 Kbp candidate BGC encoding the multi-modular enzymatic machinery (hybrid Type I- trans -AT polyketide synthase-non-ribosomal peptide synthetase and tailoring functional domains) was identified and found to harbor key features predicted as necessary for palmerolide A biosynthesis. Surveys of ascidian microbiome samples targeting the candidate BGC revealed a high correlation between palmerolide-gene targets and a single 16S rRNA gene variant (R=0.83 – 0.99). Through repeated rounds of metagenome sequencing followed by binning contigs into metagenome-assembled genomes, we were able to retrieve a near-complete genome (10 contigs) of the BGC-producing organism, a novel verrucomicrobium within the Opitutaceae family that we propose here as Candidatus Synoicihabitans palmerolidicus. The refined genome assembly harbors five highly similar BGC copies, along with structural and functional features that shed light on the host-associated nature of this unique bacterium. Importance Palmerolide A has potential as a chemotherapeutic agent to target melanoma. We interrogated the microbiome of the Antarctic ascidian, Synoicum adareanum , using a cultivation-independent high-throughput sequencing and bioinformatic strategy. The metagenome-encoded biosynthetic machinery predicted to produce palmerolide A was found to be associated with the genome of a member of the S. adareanum core microbiome. Phylogenomic analysis suggests the organism represents a new deeply-branching genus, Candidatus Synoicihabitans palmerolidicus, in the Opitutaceae family of the Verrucomicrobia phylum. The Ca . S. palmerolidicus 4.29 Mb genome encodes a repertoire of carbohydrate-utilizing and transport pathways enabling its ascidian-associated lifestyle. The palmerolide-producer’s genome also contains five distinct copies of the large palmerolide biosynthetic gene cluster that may provide structural complexity of palmerolide variants.

Abstract Polar marine ecosystems hold the potential for bioactive compound biodiscovery, based on their untapped macro- and microorganismal diversity. Characterization of polar benthic marine invertebrate-associated microbiomes is limited to few studies. This study was motivated by our interest in better understanding the microbiome structure and composition of the ascidian, Synoicum adareanum , in which the bioactive macrolide that has specific activity to melanoma, palmerolide A (PalA), was found. PalA bears structural resemblance to a combined nonribosomal peptide polyketide, that has similarities to microbially-produced macrolides. We conducted a spatial survey to assess both PalA levels and microbiome composition in S. adareanum in a region of the Antarctic Peninsula near Anvers Island (64° 46'S, 64° 03'W). PalA was ubiquitous and abundant across a collection of 21 ascidians (3 subsamples each) sampled from seven sites across the Anvers Island archipelago. The microbiome composition (V3-V4 16S rRNA gene sequence variants) of these 63 samples revealed a core suite of 21 bacteria, 20 of which were distinct from regional bacterioplankton. Co-occurrence analysis yielded several potentially interacting subsystems and, although the levels of PalA detected were not found to correlate with specific sequence variants, the core members appeared to occur in a preferred optimum and tolerance range of PalA levels. Taking these results together with an analysis of biosynthetic potential of related microbiome taxa indicates a core microbiome with substantial promise for natural product biosynthesis that likely interact with the host and with each other.

Abstract Complex interactions exist between microbiomes and their hosts. Increasingly, defensive metabolites that have been attributed to host biosynthetic capability are now being recognized as products of host-associated microbes. These unique metabolites often have bioactivity targets in human disease and can be purposed as pharmaceuticals. Polyketides are a complex family of natural products that often serve as defensive metabolites for competitive or pro-survival purposes for the producing organism, while demonstrating bioactivity in human diseases as cholesterol lowering agents, anti-infectives, and anti-tumor agents. Marine invertebrates and microbes are a rich source of polyketides. Palmerolide A, a polyketide isolated from the Antarctic ascidian Synoicum adareanum , is a vacuolar-ATPase inhibitor with potent bioactivity against melanoma cell lines. The biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for production of secondary metabolites are encoded in the genomes of the producers as discrete genomic elements. A candidate palmerolide BGC was identified from a S. adareanum microbiome-metagenome based on a high degree of congruence with a chemical structure-based retrobiosynthetic prediction. Protein family homology analysis, conserved domain searches, active site and motif identification were used to identify and propose the function of the ∼75 kb trans -acyltransferase (AT) polyketide synthase-non-ribosomal synthase (PKS-NRPS) domains responsible for the stepwise synthesis of palmerolide A. Though PKS systems often act in a predictable co-linear sequence, this BGC includes multiple trans -acting enzymatic domains, a non-canonical condensation termination domain, a bacterial luciferase-like monooxygenase (LLM), and is found in multiple copies within the metagenome-assembled genome (MAG). Detailed inspection of the five highly similar pal BGC copies suggests the potential for biosynthesis of other members of the palmerolide chemical family. This is the first delineation of a biosynthetic gene cluster from an Antarctic microbial species, recently proposed as Candidatus Synoicohabitans palmerolidicus. These findings have relevance for fundamental knowledge of PKS combinatorial biosynthesis and could enhance drug development efforts of palmerolide A through heterologous gene expression.

Continued advancements in sequencing technologies have fueled the development of new sequencing applications and promise to flood current databases with raw data. A number of factors prevent the seamless and easy use of these data, including the breadth of project goals, the wide array of tools that individually perform fractions of any given analysis, the large number of associated software/hardware dependencies, and the detailed expertise required to perform these analyses. To address these issues, we have developed an intuitive web-based environment with a wide assortment of integrated and cutting-edge bioinformatics tools. These preconfigured workflows provide even novice next-generation sequencing users with the ability to perform many complex analyses with only a few mouse clicks, and, within the context of the same environment, to visualize and further interrogate their results. This bioinformatics platform is an initial attempt at Empowering the Development of Genomics Expertise (EDGE) in a wide range of applications.

Next-generation sequencing is increasingly being used to examine closely related organisms. However, while genome-wide single nucleotide polymorphisms (SNPs) provide an excellent resource for phylogenetic reconstruction, to date evolutionary analyses have been performed using different ad hoc methods that are not often widely applicable across different projects. To facilitate the construction of robust phylogenies, we have developed a method for genome-wide identification/characterization of SNPs from sequencing reads and genome assemblies. Our phylogenetic and molecular evolutionary (PhaME) analysis software is unique in its ability to take reads and draft/complete genome(s) as input, derive core genome alignments, identify SNPs, construct phylogenies and perform evolutionary analyses. Several examples using genomes and read datasets for bacterial, eukaryotic and viral linages demonstrate the broad and robust functionality of PhaME. Furthermore, the ability to incorporate raw metagenomic reads from clinical samples with suspected infectious agents shows promise for the rapid phylogenetic characterization of pathogens within complex samples.

The assembly of high-quality genomes from mixed microbial samples is a long-standing challenge in genomics and metagenomics. Here, we describe the application of ProxiMeta, a Hi-C-based metagenomic deconvolution method, to deconvolve a human fecal metagenome. This method uses the intra-cellular proximity signal captured by Hi-C as a direct indicator of which sequences originated in the same cell, enabling culture-free de novo deconvolution of mixed genomes without any reliance on a priori information. We show that ProxiMeta deconvolution provides results of markedly high accuracy and sensitivity, yielding 50 near-complete microbial genomes (many of which are novel) from a single fecal sample, out of 252 total genome clusters. ProxiMeta outperforms traditional contig binning at high-quality genome reconstruction. ProxiMeta shows particularly good performance in constructing high-quality genomes for diverse but poorly-characterized members of the human gut. We further use ProxiMeta to reconstruct genome plasmid content and sharing of plasmids among genomes — tasks that traditional binning methods usually fail to accomplish. Our findings suggest that Hi-C-based deconvolution can be useful to a variety of applications in genomics and metagenomics.