Cyclic Arg‐Gly‐Asp‐Phe‐Val peptides with either D‐Phe or D‐Val residues were 20‐ to more than 100‐fold better inhibitors of cell adhesion to vitronectin and/or laminin fragment P1 when compared to a linear variant or Gly‐Arg‐Gly‐Asp‐Ser. No or only little increase in inhibitory capacity was observed for fibronectin adhesion and for the binding or platelet receptor αIIbβ3 to fibrinogen. NMR studies of the two most active cyclic peptides showed for both an all‐ trans conformation with a βII′ and γ turn. Subtle conformational differences, however, exist between both peptides and may contribute to selectivity or inhibition.

Significance Snake venoms are toxic protein cocktails used for prey capture. To investigate the evolution of these complex biological weapon systems, we sequenced the genome of a venomous snake, the king cobra, and assessed the composition of venom gland expressed genes, small RNAs, and secreted venom proteins. We show that regulatory components of the venom secretory system may have evolved from a pancreatic origin and that venom toxin genes were co-opted by distinct genomic mechanisms. After co-option, toxin genes important for prey capture have massively expanded by gene duplication and evolved under positive selection, resulting in protein neofunctionalization. This diverse and dramatic venom-related genomic response seemingly occurs in response to a coevolutionary arms race between venomous snakes and their prey.

trans-epoxysuccinyl-L-leucylamino-(4-guanidino)butane; HMW-uPA, high molecular weight form of uPA (enzymatically active)

Abstract Convergent evolution provides unparalleled insights into the selective drivers underlying evolutionary change. While snakes use venom primarily for predation, and venom composition often reflects diet specificity, three lineages of spitting cobras have independently evolved the ability to use venom as a defensive projectile. Using gene, protein and functional analyses, we show that the three spitting lineages possess venom characterized by an upregulation of PLA 2 toxins, which potentiate the action of venom cytotoxins to activate mammalian sensory neurons and cause enhanced pain. These repeated independent changes provide a fascinating example of convergent evolution across multiple phenotypic levels driven by exaptations. Notably, the timing of their origins suggests that defensive venom spitting may have evolved in response to the emergence of bipedal hominids in Africa and Asia. One Sentence Summary Venom spitting by snakes coincides with the emergence of hominins and is underpinned by convergent increases in pain-enhancing toxins

Understanding the relationship between genome, phenotypic variation, and the ecological pressures that act to maintain that variation, represents a fundamental challenge in evolutionary biology. Functional polymorphisms typically segregate in spatially isolated populations [1, 2] and/or discrete ecological conditions [3-5], whereas dissecting the evolutionary processes involved in adaptive geographic variation across a continuous spatial distribution is much more challenging [6]. Additionally, pleiotropic interactions between genes and phenotype often complicate the identification of specific genotype-phenotype links [7-8], and thus of the selective pressures acting on them. Animal venoms are ideal systems to overcome these constraints: they are complex and variable, yet easily quantifiable molecular phenotypes with a clear function and a direct link to both genome and fitness [9]. Here, we use dense and widespread population-level sampling of the Mohave rattlesnake, Crotalus scutulatus, and show that genomic structural variation at multiple loci underlies extreme geographic variation in venom composition, which is maintained despite extensive gene flow. Unexpectedly, selection for diet does not explain venom variation, contrary to the dominant paradigm of venom evolution, and neither does neutral population structure caused by past vicariance. Instead, different toxin genes correlate with distinct environmental factors, suggesting that divergent selective pressures can act on individual loci independently of their genomic proximity or co-expression patterns. Local-scale spatial heterogeneity thus appears to maintain a remarkably ancient complex of molecular phenotypes, which have been retained in populations that diverged more than 1.5-2 MYA, representing an exceptional case of long-term structural polymorphism. These results emphasize how the interplay between genomic architecture and spatial heterogeneity in selective pressures may facilitate the retention of functional polymorphisms of an adaptive phenotype.

This study investigated the intraspecific and interspecific variability in the venom effects of Agkistrodon viperid snake species and subspecies (eleven venoms total) on plasma clotting times, fibrinogen levels, and fibrin clot strength. Significant delays in plasma clotting time were observed for A. conanti, A. contortrix mokasen, A. contortrix phaeogaster, A. howardgloydi, A. piscivorus leucostoma, and A. piscivorus piscivorus. Notably, the phylogenetically disjunct lineages A. conanti, A. contortrix mokasen, and A. howardgloydi exhibited the most potent anticoagulant effects, indicating the independent amplification of a basal trait. Inhibition assays with the activated clotting enzymes Factors XIa, IXa, Xa, and IIa (thrombin) revealed that FXa inhibition is another basal trait amplified independently on multiple occasions within the genus, but with A. howardgloydi, notably more potent than all others. Phospholipid degradation and zymogen destruction were identified as mechanisms underlying the variability in venom effects observed experimentally and in previous clinical reports. Thromboelastography demonstrated that the venoms did not clot fibrinogen directly but affected fibrin clot strength by damaging fibrinogen and that thrombin was subsequently only able to cleave into weak, unstable clots. The ability to activate Protein C, an endogenous anticoagulant enzyme, varied across species, with some venoms exceeding that of A. contortrix contortrix, which previously yielded the protein diagnostic agent Protac®. Phylogenetic analysis suggested that both fibrinogen degradation and Protein C activation were each amplified multiple times within the genus, albeit with negative correlation between these two modes of action. This study highlights the evolutionary, clinical, and biodiscovery implications of venom variability in the Agkistrodon species, underscoring their dynamic evolution, emphasising the need for tailored clinical approaches, and highlighting the potential for novel diagnostic and therapeutic developments inspired by the unique properties of snake venoms.

Abstract Venoms have traditionally been studied from a proteomic and/or transcriptomic perspective, often overlooking the true genetic complexity underlying venom production. The recent surge in genome-based venom research (sometimes called “venomics”) has proven to be instrumental in deepening our molecular understanding of venom evolution, particularly through the identification and mapping of toxin-coding loci across the broader chromosomal architecture. Although venomous snakes are a model system in venom research, the number of high-quality reference genomes in the group remains limited. In this study, we present a chromosome-resolution reference genome for the Arabian horned viper ( Cerastes gasperettii ), a venomous snake native to the Arabian Peninsula. Our highly-contiguous genome allowed us to explore macrochromosomal rearrangements within the Viperidae family, as well as across squamates. We identified the main highly-expressed toxin genes compousing the venom’s core, in line with our proteomic results. We also compared microsyntenic changes in the main toxin gene clusters with those of other venomous snake species, highlighting the pivotal role of gene duplication and loss in the emergence and diversification of Snake Venom Metalloproteinases (SVMPs) and Snake Venom Serine Proteases (SVSPs) for Cerastes gasperettii . Using Illumina short-read sequencing data, we reconstructed the demographic history and genome-wide diversity of the species, revealing how historical aridity likely drove population expansions. Finally, this study highlights the importance of using long-read sequencing as well as chromosome-level reference genomes to disentangle the origin and diversification of toxin gene families in venomous species.

Snakebite envenoming causes 138,000 deaths annually and ~400,000 victims are left with permanent disabilities. Envenoming by saw-scaled vipers (Viperidae: Echis) leads to systemic hemorrhage and coagulopathy, and represents a major cause of snakebite mortality and morbidity in Africa and Asia. The only specific treatment for snakebite, antivenom, has poor specificity, low affordability, and must be administered in clinical settings due to its intravenous delivery and high rates of adverse reactions. This requirement results in major treatment delays in resource-poor regions and impacts substantially on patient outcomes following envenoming. Here we investigated the value of metal chelators as novel community-based therapeutics for snakebite. Among the tested chelators, dimercaprol (British anti-Lewisite) and its derivative 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid (DMPS), were found to potently antagonize the activity of Zn2+-dependent snake venom metalloproteinase toxins in vitro. Moreover, DMPS prolonged or conferred complete survival in murine preclinical models of envenoming against a variety of saw-scaled viper venoms. DMPS also significantly extended survival in a challenge and treat model, where drug administration was delayed post-venom injection, and the oral administration of this chelator provided partial protection against envenoming. Finally, the potential clinical scenario of early oral DMPS therapy combined with a later, delayed, intravenous dose of conventional antivenom provided prolonged protection against the lethal effects of envenoming in vivo. Our findings demonstrate that safe and affordable repurposed metal chelators effectively neutralize saw-scaled viper venoms in vitro and in vivo and highlight the great promise of DMPS as a novel, community-based, early therapeutic intervention for hemotoxic snakebite envenoming.

Abstract New treatments that circumvent the pitfalls of traditional antivenom therapies are critical to address the problem of snakebite globally. Numerous snake venom toxin inhibitors have shown promising cross-species neutralization of medically significant venom toxins in vivo and in vitro . The development of high-throughput approaches for the screening of such inhibitors could accelerate their identification, testing, and implementation, and thus holds exciting potential for improving the treatments and outcomes of snakebite envenomation worldwide. Energetics-based proteomic approaches, including Thermal Proteome Profiling (TPP) and Proteome Integral Solubility Alteration (PISA), assays represent “deep proteomics” methods for high throughput, proteome-wide identification of drug targets and ligands. In the following study, we apply TPP and PISA methods to characterize the interactions between venom toxin proteoforms in Crotalus atrox (Western Diamondback Rattlesnake) and the snake venom metalloprotease (SVMP) inhibitor marimastat. We investigate its venom proteome-wide effects and characterize its interactions with specific SVMP proteoforms, as well as its potential targeting of non-SVMP venom toxin families. We also compare the performance of PISA thermal window and soluble supernatant with insoluble precipitate using two inhibitor concentrations, providing the first demonstration of the utility of a sensitive high-throughput PISA-based approach to assess the direct targets of small molecule inhibitors for snake venom.