Nuclear myosin VI (MVI) enhances RNA polymerase II – dependent transcription, but the molecular mechanism is unclear. We used live cell single molecule tracking to follow individual MVI molecules inside the nucleus and observed micrometer-long motion of the motor. Besides static chromatin interactions lasting for tens of seconds, ATPase-dependent directed motion occurred with a velocity of 2 µm/s. The movement was frequently interrupted by short periods of slow restricted diffusion and increased in frequency upon stimulation of transcription. Mutagenesis and perturbation experiments demonstrated that nuclear MVI motion is independent of dimerization and occurs on nuclear actin filaments, which we also observed by two-color imaging. Using chromosome paint to quantify distances between chromosomes, we found that MVI is required for transcription-dependent long-range chromatin rearrangements. Our measurements reveal a transcription-coupled function of MVI in the nucleus, where it actively undergoes directed movement along nuclear actin filaments. Motion is potentially mediated by cooperating monomeric motors and might assist in enhancing transcription by supporting long-range chromatin rearrangements.

SUMMARY During transcription, RNA Polymerase II (RNAPII) is spatially organised within the nucleus into clusters that correlate with transcription activity. While this is a hallmark of genome regulation in mammalian cells, the mechanisms concerning the assembly, organisation and stability which underpin the function these transcription factories remain unknown. Here, we have used combination of single molecule imaging and genomic approaches to explore the role of nuclear myosin VI in the nanoscale organisation of RNAPII. We reveal that myosin VI acts as the molecular anchor that holds RNAPII into transcription factories. Perturbation of myosin VI leads to the disruption of RNAPII localisation, changes in chromatin organisation and subsequently a decrease in gene expression. Overall, we uncover the fundamental role of myosin VI in the spatial regulation of gene expression during the rapid response to changes in the cellular environment.

ABSTRACT Myosin VI is the only minus-end actin motor and is coupled to various cellular processes ranging from endocytosis to transcription. This multi-potent nature is achieved through alternative isoform splicing and interactions with a network of binding partners. There is a complex interplay between isoforms and binding partners to regulate myosin VI. Here, we have compared the regulation of two myosin VI splice isoforms by two different binding partners. By combining biochemical and single-molecule approaches, we propose that myosin VI regulation follows a generic mechanism, independently of the spliced isoform and the binding partner involved. We describe how myosin VI adopts an autoinhibited backfolded state which is released by binding partners. This unfolding activates the motor, enhances actin binding and can subsequently trigger dimerization. We have further expanded our study by using single molecule imaging to investigate the impact of binding partners upon myosin VI molecular organisation and dynamics.

ABSTRACT Mechanobiology is focused on how the physical forces and the mechanical properties of proteins, cells and tissues contribute to physiology and disease. While the response of proteins and cells to mechanical stimuli is critical for function, the tools to probe these activities are typically restricted to single molecule manipulations. Here, we have developed a novel microplate reader assay to encompass mechanical measurements with ensemble biochemical and cellular assays, using a microplate lid modified with magnets. This configuration enables multiple static magnetic tweezers to function simultaneously across the microplate, thereby greatly increasing throughput. The broad applicability and versatility of our approach has been demonstrated through in vitro force-induced enzymatic activity and conformation changes, along with force-induced receptor activation and their downstream signalling pathways in live cells. Overall, our methodology allows for the first-time ensemble biochemical and cell-based assays to be performed under force, in high throughput format. This novel approach would substantially add to the mechano-biological toolbox and increase the availability of mechanobiology measurements.

Melanoma is an aggressive skin cancer developing from melanocytes, frequently resulting in metastatic disease. Melanoma cells utilise amoeboid migration as mode of local invasion. Amoeboid invasion is characterized by rounded cell morphology and high actomyosin contractility driven by the RhoA signalling pathway. Migrastatic drugs targeting actin polymerization and contractility to inhibit invasion and metastasis are therefore a promising treatment option. To predict amoeboid invasion and metastatic potential, there is a need for biomarkers functionally linked to contractility pathways. The glycoprotein podoplanin drives actomyosin contractility in lymphoid fibroblasts, and is overexpressed in several cancer types. Here, we show that podoplanin enhances amoeboid invasion in melanoma. Expression of podoplanin in murine melanoma models drives rounded cell morphology, increasing motility and invasion in vivo . Podoplanin expression is upregulated in a subset of dedifferentiated human melanoma, and in vitro is sufficient to suppress melanogenesis and upregulate melanoma-associated markers Mitf and Pou3f2 . Together, our data indicates that podoplanin is both a potential biomarker for dedifferentiated invasive melanoma and a promising migrastatic therapeutic target.

Lymph nodes are uniquely organised to form specialised niches for immune interactions. Fibroblastic reticular cells (FRCs) are an essential stromal component of lymph nodes – forming intricate 3-dimensional networks to facilitate communication between immune cells and depositing and ensheathing extracellular matrix on the conduit network. However, beyond these structural roles, FRCs regulate immune function through the production of growth factors, chemokines and inflammatory cues. Here we sought to determine how the immunoregulatory properties of FRCs are determined. Since PDPN has been implicated in lymph node development, we directly tested how the PDPN/CLEC-2 signalling axis impacted the immunoregulatory properties of FRCs in vitro and in vivo . We find that FRCs use the PDPN/CLEC-2 signalling axis to switch transcriptional states and alter the expression of immune related genes. In vivo , genetic deletion of PDPN from fibroblastic stroma in PDGFR α mGFPΔPDPN mice downregulated key immunoregulatory molecules CCL21, VCAM-1 and ICAM-1 and attenuated the activation, proliferation and differentiation of lymphocyte populations. Further, PDGFR α mGFPΔPDPN mice exhibited severe disruption of the FRC network structure, leading to a failure to separate B and T lymphocytes and misdistribution of myeloid cells through the tissue. We conclude that PDPN expression controls signalling pathways beyond cytoskeletal regulation and cell mechanics and that PDPN expression is required for FRC phenotype and function in lymph nodes.

ABSTRACT Mammalian cells are constantly subjected to a variety of DNA damaging events that lead to the activation of DNA repair pathways. Understanding the molecular mechanisms of the DNA damage response allows the development of therapeutics which target elements of these pathways. Double-Strand Breaks (DSB) are particularly deleterious to cell viability and genome stability. Typically, DSB repair is studied using DNA damaging agents such as ionising irradiation or genotoxic drugs. These induce random lesions at non-predictive genome sites, where damage dosage is difficult to control. Such interventions are unsuitable for studying how different DNA damage recognition and repair pathways are invoked at specific DSB sites in relation to the local chromatin state. The RNA-guided Cas9 (CRISPR associated protein 9) endonuclease enzyme, is a powerful tool to mediate targeted genome alterations. Cas9-based genomic intervention is attained through DSB formation in the genomic area of interest. Here, we have harnessed the power to induce DSBs at defined quantities and locations across the human genome, using custom-designed promiscuous guide RNAs, based on in silico predictions. This was achieved using electroporation of recombinant Cas9-guide complex which provides a generic, low-cost and rapid methodology for inducing controlled DNA damage in cell culture models.

Gene expression, catalysed by RNA polymerases, is one of the most fundamental processes in living cells. Yet, the means to study their activity are currently limited. The majority of methods to quantify mRNA are based upon initial purification of the nucleic acid. This leads to experimental inaccuracies and loss of product. Here, we describe the use of a reagentless mRNA fluorescent biosensor based upon the single stranded binding (SSB) protein. In this study, SSB showed similar binding properties to mRNA, to that of its native substrate, ssDNA. Furthermore, fluorescently labelled MDCC-SSB gave the same fluorescence response with both ssDNA and ssRNA, in a concentration dependent manner. When directly compared to RT-qPCR, we found the biosensor to be more reproducible with no product lost through purification. Therefore, the MDCC-SSB is a novel tool for comparative measurement of mRNA yield following in vitro transcription.

BORIS/CTCFL, a paralogue of the chromatin architectural protein CTCF, is a member of the cancer-testis antigen family, normally present in the testes. BORIS is expressed in various tumours, including prostate cancers, however the function of BORIS in cancer cells is not well defined. The androgen receptor (AR) plays a critical role in the normal development of a human prostate gland and pathogenesis of prostate cancer. In our previous study we described a positive correlation between elevated levels of BORIS and AR in prostate cancers, and activation of the AR gene by BORIS in prostate cancer cells. Elucidation of the mechanisms involved in the modulation of AR activity is important to understand prostate tumourigenesis and investigation of transcriptional regulation of the AR gene by BORIS may provide new insights into this issue. Here we report the ability of BORIS to not only positively regulate AR in androgen-dependent prostate cancer (ADPC) cells, but re-activate epigenetically silenced AR in androgen-independent prostate cancer (AIPC) cells leading to the production of biologically active AR protein. CTCF, on the other hand, had repressive effects on the AR. In both, ADPC and AIPC cells, introduction of ectopic BORIS was associated with the reduction in the AR promoter methylation, increase in active and decrease in repressive chromatin marks, and decrease in CTCF occupancies at the two main upstream BORIS/CTCF binding sites. We propose a model of epigenetic regulation of AR by BORIS in prostate cells whereby BORIS remodels the chromatin at the AR promoter leading to transcriptional activation.

Myosin VI is involved in a variety of cellular processes ranging from endocytosis to transcription. This multi-functional potential is achieved through alternative isoform splicing and through the interaction with a diverse network of binding partners. However, the interplay between the two modes of regulation remains unexplored. To this end, we have compared two different binding partners, Dab2 and CALCOCO2/NDP52, and their interaction with two myosin VI splice isoforms. We found that both isoforms adopt an auto-inhibited state and are subsequently activated by binding partner association. However, differential regulation is achieved through a high and a low affinity binding motifs within myosin VI, with one isoform having the high affinity site blocked. This allows competition between partners and links isoform splicing with binding partner selectivity. Dab2 competition hinders the activity of nuclear myosin VI by preventing DNA binding and transcription. Moreover, re-introduction of Dab2 in the Dab2-deficient MCF-7 cells leads to a decrease in myosin VI-dependent estrogen receptor gene expression. We propose that the frequent loss of Dab2 during the onset of cancer enables a higher level of nuclear myosin VI activity, thereby driving the activity of the estrogen receptor to promote tumourgenesis.