An essential mechanism for SARS-CoV-1 and -2 infection begins with the viral spike protein binding to the human receptor protein angiotensin-converting enzyme II (ACE2). Here we describe a stepwise engineering approach to generate a set of affinity optimized, enzymatically inactivated ACE2 variants that potently block SARS-CoV-2 infection of cells. These optimized receptor traps tightly bind the receptor binding domain (RBD) of the viral spike protein and prevent entry into host cells. We first computationally designed the ACE2-RBD interface using a two-stage flexible protein backbone design process that improved affinity for the RBD by up to 12-fold. These designed receptor variants were affinity matured an additional 14-fold by random mutagenesis and selection using yeast surface display. The highest affinity variant contained seven amino acid changes and bound to the RBD 170-fold more tightly than wild-type ACE2. With the addition of the natural ACE2 collectrin domain and fusion to a human Fc domain for increased stabilization and avidity, the most optimal ACE2 receptor traps neutralized SARS-CoV-2 pseudotyped lentivirus and authentic SARS-CoV-2 virus with half-maximal inhibitory concentrations (IC50) in the 10-100 ng/ml range. Engineered ACE2 receptor traps offer a promising route to fighting infections by SARS-CoV-2 and other ACE2-utilizing coronaviruses, with the key advantage that viral resistance would also likely impair viral entry. Moreover, such traps can be predesigned for viruses with known entry receptors for faster therapeutic response without the need for neutralizing antibodies isolated or generated from convalescent patients.

Abstract Characterization of cell surface proteome differences between cancer and healthy cells is a valuable approach for the identification of novel diagnostic and therapeutic targets. However, selective sampling of surface proteins for proteomics requires large samples (>10e7 cells) and long labeling times. These limitations preclude analysis of material-limited biological samples or the capture of rapid surface proteomic changes. Here, we present two labeling approaches to tether exogenous peroxidases (APEX2 and HRP) directly to cells, enabling rapid, small-scale cell surface biotinylation without the need to engineer cells. We used a novel lipidated DNA-tethered APEX2 (DNA-APEX2), which upon addition to cells promoted cell agnostic membrane-proximal labeling. Alternatively, we employed horseradish peroxidase (HRP) fused to the glycan binding domain of wheat germ agglutinin (WGA-HRP). This approach yielded a rapid and commercially inexpensive means to directly label cells containing common N-Acetylglucosamine (GlcNAc) and sialic acid glycans on their surface. The facile WGA-HRP method permitted high surface coverage of cellular samples and enabled the first comparative surface proteome characterization of cells and cell-derived exosomes, leading to the robust quantification of 1,020 cell and exosome surface proteins. We identified a newly-recognized subset of exosome-enriched markers, as well as proteins that are uniquely upregulated on Myc oncogene-transformed prostate cancer exosomes. These two cell-tethered enzyme surface biotinylation approaches are highly advantageous for rapidly and directly labeling surface proteins across a range of material-limited sample types.

Our understanding of translation is one cornerstone of molecular biology that underpins our capacity to engineer living matter. The canonical start codon (AUG) and a few near-cognates (GUG, UUG) are typically considered as the start codons for translation initiation in Escherichia coli (E. coli). Translation is typically not thought to initiate from the 61 remaining codons. Here, we systematically quantified translation initiation in E. coli from all 64 triplet codons. We detected protein synthesis above background initiating from at least 46 codons. Translation initiated from these non-canonical start codons at levels ranging from 0.01% to 2% relative to AUG. Translation initiation from non-canonical start codons may contribute to the synthesis of peptides in both natural and synthetic biological systems.

Foreign epitopes for immune recognition provide the basis of anticancer immunity. Due to the high concentration of extracellular adenosine triphosphate in the tumor microenvironment, we hypothesized that extracellular kinases (ectokinases) could have dysregulated activity and introduce aberrant phosphorylation sites on cell surface proteins. We engineered a cell-tethered version of the extracellular kinase CK2α, demonstrated it was active on cells under tumor-relevant conditions, and profiled its substrate scope using a chemoproteomic workflow. We then demonstrated that mice developed polyreactive antisera in response to syngeneic tumor cells that had been subjected to surface hyperphosphorylation with CK2α. Interestingly, these mice developed B cell and CD4

Summary New epitopes for immune recognition provide the basis of anticancer immunity. Due to the high concentration of extracellular adenosine triphosphate in the tumor microenvironment, we hypothesized that extracellular kinases (ectokinases) could have dysregulated activity and introduce aberrant phosphorylation sites on cell surface proteins. We engineered a cell-tethered version of the extracellular kinase CK2α, demonstrated it was active on cells under tumor-relevant conditions, and profiled its substrate scope using a chemoproteomic workflow. We then demonstrated that mice developed polyreactive antisera in response to syngeneic tumor cells that had been subjected to surface hyperphosphorylation with CK2α. Interestingly, these mice developed B cell and CD4+ T cell responses in response to these antigens but failed to develop a CD8+ T cell response. This work provides a workflow for probing the extracellular phosphoproteome and demonstrates that extracellular phosphoproteins are immunogenic even in a syngeneic system.

The SARS-CoV-2 Omicron variant, with 15 mutations in Spike receptor binding domain (Spike-RBD), renders virtually all clinical monoclonal antibodies against WT SARS-CoV-2 ineffective. We recently engineered the SARS-CoV-2 host entry receptor, ACE2, to tightly bind WT-Spike-RBD and prevent viral entry into host cells ("receptor traps"). Here we determine cryo-EM structures of our receptor traps in complex with full length Spike. We develop a multi-model pipeline combining Rosetta protein modeling software and cryo-EM to allow interface energy calculations even at limited resolution and identify interface side chains that allow for high affinity interactions between our ACE2 receptor traps and Spike-RBD. Our structural analysis provides a mechanistic rationale for the high affinity (0.53 - 4.2nM) binding of our ACE2 receptor traps to Omicron-RBD confirmed with biolayer interferometry measurements. Finally, we show that ACE2 receptor traps potently neutralize Omicron- and Delta-pseudotyped viruses, providing alternative therapeutic routes to combat this evolving virus.