Neural circuits underlying brain functions are vulnerable to damage, including ischemic injury, leading to neuronal loss and gliosis. Recent technology of direct conversion of endogenous astrocytes into neurons in situ can simultaneously replenish the neuronal population and reverse the glial scar. However, whether these newly reprogrammed neurons undergo normal development, integrate into the existing neuronal circuit, and acquire functional properties specific for this circuit is not known. We investigated the effect of NeuroD1-mediated in vivo direct reprogramming on visual cortical circuit integration and functional recovery in a mouse model of ischemic injury. After performing electrophysiological extracellular recordings and two-photon calcium imaging of reprogrammed cells in vivo and mapping the synaptic connections formed onto these cells ex vivo , we discovered that NeuroD1 reprogrammed neurons were integrated into the cortical microcircuit and acquired direct visual responses. Furthermore, following visual experience, the reprogrammed neurons demonstrated maturation of orientation selectivity and functional connectivity. Our results show that NeuroD1-reprogrammed neurons can successfully develop and integrate into the visual cortical circuit leading to vision recovery after ischemic injury.

Infections and neurodegenerative diseases induce neuroinflammation, but affected individuals often show a number of non-neural symptoms including muscle pain and muscle fatigue. The molecular pathways by which neuroinflammation causes pathologies outside the central nervous system (CNS) are poorly understood, so we developed three models to investigate the impact of neuroinflammation on muscle performance. We found that bacterial infection, COVID-like viral infection, and expression of a neurotoxic protein associated with Alzheimer′ s disease promoted the accumulation of reactive oxygen species (ROS) in the brain. Excessive ROS induces the expression of the cytokine Unpaired 3 (Upd3) in insects, or its orthologue IL-6 in mammals, and CNS-derived Upd3/IL-6 activates the JAK/Stat pathway in skeletal muscle. In response to JAK/Stat signaling, mitochondrial function is impaired and muscle performance is reduced. Our work uncovers a brain-muscle signaling axis in which infections and chronic diseases induce cytokine-dependent changes in muscle performance, suggesting IL-6 could be a therapeutic target to treat muscle weakness caused by neuroinflammation.

ABSTRACT Regenerating functional new neurons in adult mammalian brains has been proven a difficult task for decades. Recent advancement in direct glia-to-neuron conversion in vivo opens a new field for neural regeneration and repair. However, this emerging new field is facing serious challenges from misuse of viral vectors to misinterpretation of conversion data. Here, we employ a variety of AAV vectors with different promoters and enhancers to demonstrate that astrocytes can be converted into neurons in a NeuroD1 dose-dependent manner in both wildtype (WT) and transgenic mice. Notably, astrocytes in WT mice were relatively easy to convert with higher conversion efficiency, whereas lineage-traced astrocytes in Aldh1l1-CreERT2 mice showed high resistance to reprogramming but were still converted into neurons after enhancing NeuroD1 expression with CMV enhancer. Furthermore, under two-photon microscope, we observed direct astrocyte-to-neuron conversion within 3 weeks of serial live imaging in the mouse cortex. We also demonstrated that high titre AAV reaching 10 13 GC/ml caused severe neuronal leakage using a variety of AAV GFAP::GFP vectors, highlighting the necessity to inject low titre AAV into healthy brains to avoid artifactual results. Together, our studies suggest that lineage-traced astrocytes can be converted into neurons but require stronger conversion force such as enhanced NeuroD1 expression. Failure to recognize the difference between WT astrocytes and lineage-traced astrocytes in terms of conversion barrier will lead to misinterpretation of data.

Abstract Spinal cord injury (SCI) often leads to impaired motor and sensory functions, partially because the injury-induced neuronal loss cannot be easily replenished through endogenous mechanisms. In vivo neuronal reprogramming has emerged as a novel technology to regenerate neurons from endogenous glial cells by forced expression of neurogenic transcription factors. We have previously demonstrated successful astrocyte-to-neuron conversion in mouse brains with injury or Alzheimer’s disease by overexpressing a single neural transcription factor NeuroD1 via retroviruses. Here we demonstrate regeneration of dorsal spinal cord neurons from reactive astrocytes after SCI via adeno-associated virus (AAV), a more clinically relevant gene delivery system. We find that NeuroD1 converts reactive astrocytes into neurons in the dorsal horn of stab-injured spinal cord with high efficiency (∼95%). Interestingly, NeuroD1 -converted neurons in the dorsal horn mostly acquire glutamatergic neuronal subtype, expressing spinal cord-specific markers such as Tlx3 but not brain-specific markers such as Tbr1, suggesting that the astrocytic lineage and local microenvironment affect the cell fate of conversion. Electrophysiological recordings show that the NeuroD1 -converted neurons can functionally mature and integrate into local spinal cord circuitry by displaying repetitive action potentials and spontaneous synaptic responses. We further show that NeuroD1 -mediated neuronal conversion can occur in the contusive SCI model, allowing future studies of evaluating this reprogramming technology for functional recovery after SCI. In conclusion, this study may suggest a paradigm shift for spinal cord repair using in vivo astrocyte-to-neuron conversion technology to generate functional neurons in the grey matter.

Abstract Glioblastoma (GBM) is the most prevalent and aggressive adult primary cancer in the central nervous system (CNS). Therapeutic approaches for glioblastoma are under intense investigation, such as the emerging immunotherapy, but so far only marginal progress has been made due to the heterogeneity and highly invasive nature of glioblastoma. Here, we propose an alternative approach to tackle GBM through reprogramming proliferative GBM cells into non-proliferative neurons. We report efficient neuronal conversion from human GBM cells by overexpressing single neural transcription factor Neurogenic differentiation 1 (NeuroD1), Neurogenin-2 (Neurog2) or Achaete-scute homolog 1 (Ascl1). Subtype characterization reveals that the majority of Neurog2- and NeuroD1-converted neurons are glutamatergic, while Ascl1 favors GABAergic neuron generation. The GBM cell-converted neurons not only express pan-neuronal markers, such as NeuN and MAP2, but also exhibit neuron-specific electrophysiological activities. We further conducted transcriptome analyses to investigate the underlying cell conversion mechanism. Our RNA-seq analyses discover that neuronal genes are activated among glioma cells after overexpression of neural transcription factors, and different signaling pathways are activated by different neural transcription factors. Importantly, the neuronal conversion of GBM cells is accompanied by significant inhibition of GBM cell proliferation in both in vitro and in vivo models. Therefore, these results suggest that GBM cells can be reprogrammed into different subtypes of neurons, leading to a potential alternative approach to treat brain tumor. Significance Converting dividing glioblastoma cells into non-dividing neurons may provide an innovative therapeutic approach to treat glioblastoma. Highlights Efficient neuronal conversion of human glioblastoma cells achieved by overexpression of neural transcription factors Neurog2- and NeuroD1-converted neurons are mostly glutamatergic, while Ascl1-converted neurons are mainly GABAergic Transcriptome analyses reveal the activation of neuronal genes after overexpression of neural transcription factors in glioblastoma cells Inhibition of cell proliferation during glioblastoma cell conversion both in vitro and in vivo

Abstract In vivo astrocyte-to-neuron (AtN) conversion induced by overexpression of neural transcriptional factors has great potential for neural regeneration and repair. Here, we demonstrate that a single neural transcriptional factor Dlx2 converts mouse striatal astrocytes into neurons in a dose-dependent manner. Lineage-tracing studies in Aldh1l1-CreER T2 mice confirm that Dlx2 can convert striatal astrocytes into DARPP32 + and Ctip2 + medium spiny neurons (MSNs). Time-course studies reveal a gradual conversion from astrocytes to neurons in 1 month, with a distinct intermediate state in-between astrocytes and neurons. Interestingly, when Dlx2-infected astrocytes start to lose astrocytic markers, the other local astrocytes proliferate to maintain astrocytic level in the converted areas. Unexpectedly, while Dlx2 efficiently reprograms astrocytes into neurons in the grey matter striatum, it also induces partial reprogramming of astrocytes in the white matter corpus callosum. Such partial reprogramming of white matter astrocytes is associated with neuroinflammation, which can be essentially suppressed by the addition of NeuroD1. Our results highlight the importance of investigating AtN conversion both in the grey matter and white matter in order to thoroughly evaluate therapeutic potentials. This study also unveils a critical role of anti-inflammation by NeuroD1 during AtN conversion.

Abstract NEUROD1-induced astrocyte-to-neuron (AtN) conversion has garnered significant attention as a potential therapeutic intervention to neurological disorders. To gain insight into the molecular regulations underlying this neuronal reprogramming process, we applied single-cell multiomics analyses on in vitro ND1-induced AtN conversion to systematically investigate how ND1 changed the fate of astrocytes at transcriptomic and epigenetic levels. Our findings reveal that the initial immature astrocytes go through an intermediate state where both astrocytic and neuronal genes are activated at early stage of AtN conversion. ND1 directly reshapes the chromatin accessibility landscape of astrocytes to that of neurons, promoting expression of endogenous Neurod1 and other neurogenic genes such as Hes6, Insm1 etc. Interestingly, cell proliferation status is highly correlated with conversion rate, and inhibition of cell division significantly reduces the conversion ratio. Moreover, in comparison with another AtN reprogramming transcription factor, ASCL1, external ND1 can activate endogenous Neurod1 and directly promote neuronal gene transcription; whereas external ASCL1 hardly activates endogenous Ascl1, leading to slower and inefficient conversion. Together, our studies demonstrate that in vitro AtN conversion mimics neurogenic transcriptional program in embryonic neurogenesis.

Fine mapping and bioinformatic analysis of the DDX6-CXCR5 genetic risk association in Sjogrens Disease (SjD) and Systemic Lupus Erythematosus (SLE) identified five common SNPs with functional evidence in immune cell types: rs4938573, rs57494551, rs4938572, rs4936443, rs7117261. Functional interrogation of nuclear protein binding affinity, enhancer/promoter regulatory activity, and chromatin-chromatin interactions in immune, salivary gland epithelial, and kidney epithelial cells revealed cell type-specific allelic effects for all five SNPs that expanded regulation beyond effects on DDX6 and CXCR5 expression. Mapping the local chromatin regulatory network revealed several additional genes of interest, including lnc-PHLDB1-1. Collectively, functional characterization implicated the risk alleles of these SNPs as modulators of promoter and/or enhancer activities that regulate cell type-specific expression of DDX6, CXCR5, and lnc-PHLDB1-1, among others. Further, these findings emphasize the importance of exploring the functional significance of SNPs in the context of complex chromatin architecture in disease-relevant cell types and tissues.

Abstract AaCPR100A is a structural protein, found in the soft cuticle of Ae. Aegypti . RNAi of AaCPR100A resulted in high mortality in Ae. Aegypti and abnormal egg development in the surviving mosquitoes. Over thirty proteins that could interact with AaCPR100A were screened out by yeast two-hybrid assay, and subsequently, further verification by hybrid and GST pull-down assays identified that G12-like had the strongest interaction with AaCPR100A. RNAi of G12-like suggested it may be related to larva development. Interestingly, the adults in which the G12-like gene was knocked down were sensitive to low temperature, and their egg shell formation, production, and hatching were affected. G12-like has the opposite effect in the upstream expression of AaCPR100A , promoting AaCPR100A function in the larval stage and inhibiting AaCPR100A in the adult stage. In all, functional studies of AaCPR100A and its interaction protein G12-like provide insight into its involvement in cuticle development and formation and egg shell formation.

ABSTRACT The human pathogen Pseudomonas aeruginosa , a leading cause of hospital-acquired infections, inhabits and forms sessile antibiotic-resistant communities called biofilms in a wide range of biotic and abiotic environments. In this study, we examined how two global sensory signaling pathways – the RhlR quorum-sensing system and the CbrA/CbrB nutritional adaptation system – intersect to control biofilm development. Previous work has shown that individually these two systems repress biofilm formation. Here, we used biofilm analyses, RNA-seq, and reporter assays to explore the combined effect of information flow through RhlR and CbrA on biofilm development. We find that the Δ rhlR Δ cbrA double mutant exhibits a biofilm morphology and an associated transcriptional response distinct from wildtype and the parent Δ rhlR and Δ cbrA mutants indicating codominance of each signaling pathway. The Δ rhlR Δ cbrA mutant rapidly gains suppressor mutations that map to the carbon catabolite repression protein Crc. The combined absence of RhlR and CbrA leads to drastic reduction in the abundance of the Crc antagonist small RNA CrcZ. Thus, CrcZ acts as the molecular convergence point for quorum- and nutrient-sensing cues. Furthermore, in the absence of antagonism by CrcZ, Crc promotes the expression of biofilm matrix components – Pel exopolysaccharide, and CupB and CupC fimbriae. Therefore, this study uncovers a regulatory link between nutritional adaption and quorum sensing with potential implications for anti-biofilm targeting strategies. AUTHOR SUMMARY Bacterial pathogens often form multicellular communities encased in an extra cytoplasmic matrix called biofilms as a virulence strategy. Biofilm development is controlled by various environmental stimuli that are decoded and converted into appropriate cellular responses. How information from two or more stimuli is integrated is poorly understood. Using Pseudomonas aeruginosa biofilm formation as a model, we studied the intersection of two global sensory signaling pathways – quorum sensing and nutritional adaptation. We find parallel regulation by each pathway that converges on the abundance of a small RNA. Thus, we describe a regulatory link between P. aeruginosa quorum-sensing and nutritional adaptation pathways that allows integration of information from each system into the control of biofilm development. These results expand our understanding of the genetic regulatory strategies that allow P. aeruginosa to successfully colonize host during chronic infections.