53BP1 (also called TP53BP1) is a chromatin-associated factor that promotes immunoglobulin class switching and DNA double-strand-break (DSB) repair by non-homologous end joining. To accomplish its function in DNA repair, 53BP1 accumulates at DSB sites downstream of the RNF168 ubiquitin ligase. How ubiquitin recruits 53BP1 to break sites remains unknown as its relocalization involves recognition of histone H4 Lys 20 (H4K20) methylation by its Tudor domain. Here we elucidate how vertebrate 53BP1 is recruited to the chromatin that flanks DSB sites. We show that 53BP1 recognizes mononucleosomes containing dimethylated H4K20 (H4K20me2) and H2A ubiquitinated on Lys 15 (H2AK15ub), the latter being a product of RNF168 action on chromatin. 53BP1 binds to nucleosomes minimally as a dimer using its previously characterized methyl-lysine-binding Tudor domain and a carboxy-terminal extension, termed the ubiquitination-dependent recruitment (UDR) motif, which interacts with the epitope formed by H2AK15ub and its surrounding residues on the H2A tail. 53BP1 is therefore a bivalent histone modification reader that recognizes a histone ‘code’ produced by DSB signalling. This study shows that 53BP1 recruitment to sites of DNA damage involves dual recognition of H4K20me2 and H2AK15 histone ubiquitination; the ubiquitin mark and the surrounding epitope on H2A are read by a region of 53BP1 designated the ubiquitination-dependent recruitment motif. The key DNA damage response protein 53BP1 acts by binding to chromatin at the site of a double-strand break. Previous studies suggested that 53BP1 acts after a ubiquitination event promoted by RNF168, although its recruitment to breaks was thought to depend only on histone H4K20 methylation. Daniel Durocher and colleagues now show that 53BP1 recruitment involves the recognition of both H4K20me2 and histone H2AK15 ubiquitination. The ubiquitin mark, and the surrounding context on histone H2A, are read by a region of 53BP1 that the authors designate the ubiquitination-dependent recruitment motif.

53BP1 is a chromatin-binding protein that regulates the repair of DNA double-strand breaks by suppressing the nucleolytic resection of DNA termini

DNA repair by homologous recombination is highly suppressed in G1 cells to ensure that mitotic recombination occurs solely between sister chromatids. Although many homologous recombination factors are cell-cycle regulated, the identity of the events that are both necessary and sufficient to suppress recombination in G1 cells is unknown. Here we report that the cell cycle controls the interaction of BRCA1 with PALB2-BRCA2 to constrain BRCA2 function to the S/G2 phases in human cells. We found that the BRCA1-interaction site on PALB2 is targeted by an E3 ubiquitin ligase composed of KEAP1, a PALB2-interacting protein, in complex with cullin-3 (CUL3)-RBX1 (ref. 6). PALB2 ubiquitylation suppresses its interaction with BRCA1 and is counteracted by the deubiquitylase USP11, which is itself under cell cycle control. Restoration of the BRCA1-PALB2 interaction combined with the activation of DNA-end resection is sufficient to induce homologous recombination in G1, as measured by RAD51 recruitment, unscheduled DNA synthesis and a CRISPR-Cas9-based gene-targeting assay. We conclude that the mechanism prohibiting homologous recombination in G1 minimally consists of the suppression of DNA-end resection coupled with a multi-step block of the recruitment of BRCA2 to DNA damage sites that involves the inhibition of BRCA1-PALB2-BRCA2 complex assembly. We speculate that the ability to induce homologous recombination in G1 cells with defined factors could spur the development of gene-targeting applications in non-dividing cells.

Shutting Down Repair to Protect Cells repair DNA double-strand breaks (DSBs) by halting the cell cycle and activating the machinery involved in mending the breaks. However, during mitosis neither the DNA damage checkpoint nor DSB repair occur, apparently leaving the cell extremely vulnerable to DSBs. Orthwein et al. (p. 189 , published online 20 March) found that the DSB response was blocked by the phosphorylation of two crucial repair factors, RNF8 and PB531, preventing their recruitment to the site of damage. Restoring DSB repair during mitosis caused end-to-end chromosome fusions, which are catastrophic for chromosome segregation and normal cell division, explaining why the repair machinery is shut down during cell division.

Modulation of DNA repair pathway choice by a potent inhibitor of 53BP1 improves the efficiency of homology-dependent genome editing in human and mouse cells. Programmable nucleases, such as Cas9, are used for precise genome editing by homology-dependent repair (HDR)1,2,3. However, HDR efficiency is constrained by competition from other double-strand break (DSB) repair pathways, including non-homologous end-joining (NHEJ)4. We report the discovery of a genetically encoded inhibitor of 53BP1 that increases the efficiency of HDR-dependent genome editing in human and mouse cells. 53BP1 is a key regulator of DSB repair pathway choice in eukaryotic cells4,5 and functions to favor NHEJ over HDR by suppressing end resection, which is the rate-limiting step in the initiation of HDR. We screened an existing combinatorial library of engineered ubiquitin variants6 for inhibitors of 53BP1. Expression of one variant, named i53 (inhibitor of 53BP1), in human and mouse cells, blocked accumulation of 53BP1 at sites of DNA damage and improved gene targeting and chromosomal gene conversion with either double-stranded DNA or single-stranded oligonucleotide donors by up to 5.6-fold. Inhibition of 53BP1 is a robust method to increase efficiency of HDR-based precise genome editing.

BRCA1/2 -mutated cancer cells must adapt to the genome instability caused by their deficiency in homologous recombination. Identifying and targeting these adaptive mechanisms may provide new therapeutic strategies. Here we present the results of genome-scale CRISPR/Cas9-based synthetic lethality screens in isogenic pairs of BRCA1- and BRCA2-deficient cells that identified the gene encoding CIP2A as essential in a wide range of BRCA1 - and BRCA2 -mutated cells. Unlike PARP inhibition, CIP2A-deficiency does not cause accumulation of replication-associated DNA lesions that require homologous recombination for their repair. CIP2A is cytoplasmic in interphase but, in mitosis, accumulates at DNA lesions as part of a complex with TOPBP1, a multifunctional genome stability factor. In BRCA-deficient cells, the CIP2A-TOPBP1 complex prevents lethal mis-segregation of acentric chromosomes that arises from impaired DNA synthesis. Finally, physical disruption of the CIP2A-TOPBP1 complex is highly deleterious in BRCA-deficient cells and tumors, indicating that targeting this mitotic chromosome stability process represents an attractive synthetic-lethal therapeutic strategy for BRCA1 - and BRCA2 -mutated cancers.

Abstract The tumor suppressor BRCA1 accumulates at sites of DNA damage in a ubiquitin-dependent manner. In this work, we revisit the role of the ubiquitin-binding protein RAP80 in BRCA1 recruitment to damaged chromatin. We found that RAP80, or the phosphopeptide-binding residues in the BRCA1 BRCT domains, act redundantly with the BRCA1 RING domain to promote BRCA1 recruitment to DNA double-strand break sites. We show that that RNF8 E3 ubiquitin ligase acts upstream of both the RAP80- and RING-dependent activities whereas RNF168 acts uniquely upstream of the RING domain. The function of the RING domain in BRCA1 recruitment is not solely linked to its role in mediating an interaction with BARD1 since RING mutations that do not impact BARD1 interaction, such as the E2-binding deficient Ile26Ala (I26A) mutation, produce a BRCA1 protein unable to accumulate at DNA damage sites in the absence of RAP80. Cells that combine the BRCA1 I26A mutation and mutations that disable the RAP80-BRCA1 interaction are deficient in RAD51 filament formation and are hypersensitive to poly (ADP-ribose) polymerase inhibition. Our results suggest that in the absence of RAP80, the BRCA1 E3 ligase activity is necessary for the recognition of unmethylated histone H4 Lys20 and histone H2A Lys13/Lys15 ubiquitylation by BARD1 although we cannot rule out the possibility that the RING- E2 complex itself may facilitate ubiquitylated nucleosome recognition in other ways. Finally, given that tumors expressing RING-less BRCA1 isoforms readily acquire resistance to therapy, this work suggests that targeting RAP80, or its interaction with BRCA1, could represent a novel strategy for restoring sensitivity of such tumors to DNA damaging agents.

Summary Deficiency for the repair of DNA double-strand breaks (DSBs) via homologous recombination (HR) leads to chromosomal instability and diseases such as cancer. Yet, defective HR also results in vulnerabilities that can be exploited for targeted therapy. Here, we identify such a vulnerability and show that BRCA1-deficient cells are dependent on the long-range end-resection factor EXO1 for survival. EXO1 loss results in DNA replication-induced lesions decorated by poly(ADP-ribose)-chains. In cells that lack both BRCA1 and EXO1, this is accompanied by unresolved DSBs due to impaired single-strand annealing (SSA), a DSB repair process that requires the activity of both proteins. In contrast, BRCA2-deficient cells have increased SSA, also in the absence of EXO1, and hence are not dependent on EXO1 for survival. In agreement with our mechanistic data, BRCA1-mutated tumours have elevated EXO1 expression and contain more genomic signatures of SSA compared to BRCA1-proficient tumours. Collectively, our data indicate that EXO1 is a promising novel target for treatment of BRCA1-deficient tumours.

The ATR kinase protects cells against DNA damage and replication stress and represents a promising anti-cancer drug target. The ATR inhibitors (ATRi) berzosertib and gartisertib are in clinical trials for treatment of advanced solid tumours as monotherapy or in combination with genotoxic agents. However, the pharmacodynamic ATR biomarker phospho-CHK1 has shown limited sensitivity in for quantitative assessment of ATR activity in clinical trials. Therefore, better biomarkers are needed, and with this in mind we carried out quantitative phospho-proteomic screening for ATR biomarkers that are highly sensitive to berzosertib and gartisertib. Screening identified novel ATR-dependent targets in three broad classes: i) targets whose phosphorylation is highly sensitive to ATRi; ii) novel targets with known genome maintenance roles; iii) novel targets whose cellular roles are unclear, including SCAF1. We show that SCAF1 interacts with RNAPII in a phospho-dependent manner and suppresses homologous recombination in cells lacking the BRCA1 tumour suppressor. Taken together these data reveal potential new ATR biomarkers and new genome maintenance factors.

ABSTRACT With the recent rise in CRISPR/Cas9-mediated genome-wide synthetic lethality screens, many new synthetic lethal targets have been identified for diseases with underlying genetic causes such as tumours with BRCA1 mutations. Such screens often use full deficiency of a protein to identify novel vulnerabilities. However, patient-derived mutations not only result in loss of the protein but often also concern missense mutations with hypomorphic phenotypes. Here we study the genetic vulnerabilities of two previously described hypomorphic BRCA1 missense mutations and compare these to a BRCA1-depleted setting to study whether this affects screening for synthetic lethal interactions. Our research showed that BRCA1 I26A mutated cells have very similar vulnerabilities to BRCA1 wildtype cells, confirming its low tumorigenic effect. In contrast, the BRCA1 R1699Q mutation induced a more similar phenotype to BRCA1-deficient cells. For this mutation, we also unveiled a unique vulnerability to the loss of NDE1. Specifically in BRCA1 R1699Q mutated cells, and not BRCA1-proficient or -deficient cells, NDE1 loss leads to increased genomic instability. Altogether our findings highlight the importance to differentiate between patient-derived mutations when assessing novel treatment targets.