Summary CRISPR antiviral defense systems such as the well-known DNA-targeting Cas9- and the more complex RNA-targeting type III systems are widespread in bacteria and archea 1, 2 . The type III systems can orchestrate a complex antiviral response that is initiated by the synthesis of cyclic oligoadenylates (cOAs) upon foreign RNA recognition 3–5 . These second messenger molecules bind to the CARF (CRISPR associated Rossmann-fold) domains of dedicated effector proteins that are often DNAses, RNAses, or putative transcription factors 6 . The activated effectors interfere with cellular pathways of the host, inducing cell death or a dormant state of the cell that is better suited to avoid propagation of the viral attack 7, 8 . Among a large set of proteins that were predicted to be linked to the type III systems 9, 10 , the CRISPR-Lon protein caught our attention. The protein was predicted to be an integral membrane protein containing a SAVED-instead of a CARF-domain as well as a Lon protease effector domain. Here, we report the crystal structure of CRISPR-Lon. The protein is a soluble monomer and indeed contains a SAVED domain that accommodates cA 4 . Further, we show that CRISPR-Lon forms a stable complex with the 34 kDa CRISPR-T protein. Upon activation by cA 4 , CRISPR-Lon specifically cleaves CRISRP-T, releasing CRISPR-T 23 , a 23 kDa fragment that is structurally very similar to MazF toxins and is likely a sequence specific nuclease. Our results describe the first cOA activated proteolytic enzyme and provide the first example of a SAVED domain connected to a type III CRISPR defense system. The use of a protease as a means to unleash a fast response against a threat has intriguing parallels to eukaryotic innate immunity.

Abstract CRISPR systems are widespread in the prokaryotic world, providing adaptive immunity against mobile genetic elements 1,2 . Type III CRISPR systems, with the signature gene cas10 , use CRISPR RNA to detect non-self RNA, activating the enzymatic Cas10 subunit to defend the cell against mobile genetic elements either directly, via the integral histidine–aspartate (HD) nuclease domain 3–5 or indirectly, via synthesis of cyclic oligoadenylate second messengers to activate diverse ancillary effectors 6–9 . A subset of type III CRISPR systems encode an uncharacterized CorA-family membrane protein and an associated NrN family phosphodiesterase that are predicted to function in antiviral defence. Here we demonstrate that the CorA-associated type III-B (Cmr) CRISPR system from Bacteroides fragilis provides immunity against mobile genetic elements when expressed in Escherichia coli . However, B. fragilis Cmr does not synthesize cyclic oligoadenylate species on activation, instead generating S -adenosyl methionine (SAM)-AMP (SAM is also known as AdoMet) by conjugating ATP to SAM via a phosphodiester bond. Once synthesized, SAM-AMP binds to the CorA effector, presumably leading to cell dormancy or death by disruption of the membrane integrity. SAM-AMP is degraded by CRISPR-associated phosphodiesterases or a SAM-AMP lyase, potentially providing an ‘off switch’ analogous to cyclic oligoadenylate-specific ring nucleases 10 . SAM-AMP thus represents a new class of second messenger for antiviral signalling, which may function in different roles in diverse cellular contexts.

ABSTRACT Type III CRISPR systems detect invading RNA, resulting in the activation of the enzymatic Cas10 subunit. The Cas10 cyclase domain generates cyclic oligoadenylate (cOA) second messenger molecules, activating a variety of effector nucleases that degrade nucleic acids to provide immunity. The prophage-encoded Vibrio metoecus type III-B (VmeCmr) locus is uncharacterised, lacks the HD nuclease domain in Cas10 and encodes a NucC DNA nuclease effector that is also found associated with Cyclic-oligonucleotide-based anti-phage signalling systems (CBASS). Here we demonstrate that VmeCmr is activated by target RNA binding, generating cyclic-triadenylate (cA 3 ) to stimulate a robust NucC-mediated DNase activity. The specificity of VmeCmr is probed, revealing the importance of specific nucleotide positions in segment 1 of the RNA duplex and the protospacer flanking sequence (PFS). We harness this programmable system to demonstrate the potential for a highly specific and sensitive assay for detection of the SARS-CoV-2 virus RNA with a limit of detection (LoD) of 2 fM using a commercial plate reader without any extrinsic amplification step. The sensitivity is highly dependent on the guide RNA used, suggesting that target RNA secondary structure plays an important role that may also be relevant in vivo .

ABSTRACT Cyclic nucleotide signalling is a key component of anti-viral defence in all domains of life, from bacteria to humans. Viral detection activates a nucleotide cyclase to generate a second messenger, resulting in activation of effector proteins. This is exemplified by the metazoan cGAS-STING innate immunity pathway 1 , which originated in bacteria 2 . These defence systems require a sensor domain such as STING or SAVED to bind the cyclic nucleotide, coupled with an effector domain that causes cell death when activated by destroying essential biomolecules 3 . One example is the TIR (Toll/interleukin-1 receptor) domain, which degrades the essential cofactor NAD + when activated in response to pathogen invasion in plants and bacteria 2,4,5 or during nerve cell programmed death 6 . Here, we show that a bacterial anti-viral defence system generates a cyclic tri-adenylate (cA 3 ) signal which binds to a TIR-SAVED effector, acting as the “glue” to allow assembly of an extended superhelical solenoid structure. Adjacent TIR subunits interact to organise and complete a composite active site, allowing NAD + degradation. Our study illuminates a striking example of large-scale molecular assembly controlled by cyclic nucleotides and reveals key details of the mechanism of TIR enzyme activation.

ABSTRACT CRISPR systems are widespread in the prokaryotic world, providing adaptive immunity against mobile genetic elements (MGE) 1, 2 . Type III CRISPR systems, with the signature gene cas10 , use CRISPR RNA (crRNA) to detect non-self RNA, activating the enzymatic Cas10 subunit to defend the cell against MGE either directly, via the integral HD nuclease domain 3–5 or indirectly, via synthesis of cyclic oligonucleotide (cOA) second messengers to activate diverse ancillary effectors 6–9 . A subset of type III CRISPR systems encode an uncharacterised CorA-family membrane protein and an associated NrN family phosphodiesterase predicted to function in antiviral defence. Here, we demonstrate that the CorA associated type III-B (Cmr) CRISPR system from Bacteroides fragilis provides immunity against MGE when expressed in E. coli . However, B. fragilis Cmr does not synthesise cOA species on activation, instead generating a previously undescribed sigalling molecule, SAM-AMP (3’-adenylyl-AdoMet) by conjugating ATP to S-adenosyl methionine via a phosphodiester bond. Once synthesised, SAM-AMP binds to the CorA effector, presumably leading to cell death by disruption of the membrane integrity. SAM-AMP is degraded by CRISPR associated phosphodiesterases or a SAM-AMP lyase, providing an “off switch” analogous to cOA specific ring nucleases 10 . SAM-AMP thus represents a new class of second messenger for antiviral signalling, which may function in different roles in diverse cellular contexts.

Abstract Type III CRISPR systems detect foreign RNA and activate the cyclase domain of the Cas10 subunit, generating cyclic oligoadenylate (cOA) molecules that act as a second messenger to signal infection, activating nucleases that degrade the nucleic acid of both invader and host. This can lead to dormancy or cell death; to avoid this, cells need a way to remove cOA from the cell once a viral infection has been defeated. Enzymes specialised for this task are known as ring nucleases, but are limited in their distribution. Here, we demonstrate that the widespread CRISPR associated protein Csx3, previously described as an RNA deadenylase, is a ring nuclease that rapidly degrades cyclic tetra-adenylate (cA 4 ). The enzyme has an unusual cooperative reaction mechanism involving an active site that spans the interface between two dimers, sandwiching the cA 4 substrate. We propose the name Crn3 (CRISPR associated ring nuclease 3) for the Csx3 family.

The CRISPR system provides adaptive immunity against mobile genetic elements (MGE) in prokaryotes. In type III CRISPR systems, an effector complex programmed by CRISPR RNA detects invading RNA, triggering a multi-layered defence that includes target RNA cleavage, licencing of an HD DNA nuclease domain and synthesis of cyclic oligoadenylate (cOA) molecules. cOA activates the Csx1/Csm6 family of effectors, which degrade RNA non-specifically to enhance immunity. Type III systems are found in diverse archaea and bacteria, including the human pathogen Mycobacterium tuberculosis. Here, we report a comprehensive analysis of the in vitro and in vivo activities of the type III-A M. tuberculosis CRISPR system. We demonstrate that immunity against MGE is achieved predominantly via a cyclic hexa-adenylate (cA6) signalling pathway and the ribonuclease Csm6, rather than through DNA cleavage by the HD domain. Furthermore, we show that the mechanism can be reprogrammed to operate as a cyclic tetra-adenylate (cA4) system by replacing the effector protein. These observations demonstrate that M. tuberculosis has a fully-functioning CRISPR interference system that generates a range of cyclic and linear oligonucleotides of known and unknown functions, potentiating fundamental and applied studies.

The CRISPR-Cas system provides adaptive immunity against mobile genetic elements in prokaryotes, utilising small CRISPR RNAs which direct effector complexes to degrade invading entities. Type III effector complexes were recently demonstrated to synthesise a novel second messenger, cyclic oligoadenylate (cOA), on binding target RNA. cOA in turn binds to and activates a range of downstream effector proteins including ribonucleases (Csm6/Csx1) and transcription factors via a CARF (CRISPR associated Rossman Fold) domain, inducing an antiviral state in the cell that is important for immunity. The mechanism of the off-switch that resets the system is not understood. Here, we report the identification of the nuclease that degrades these cOA ring molecules. The Ring nuclease is itself a CARF family protein with a metal independent mechanism, which cleaves cOA4 rings to generate linear di-adenylate species and switches off the antiviral state. The identification of Ring nucleases adds an important insight to the CRISPR-Cas system.

Type III CRISPR systems synthesise cyclic oligoadenylate (cOA) second messengers in response to viral infection of bacteria and archaea, potentiating an immune response by binding and activating ancillary effector nucleases such as Csx1. As these effectors are not specific for invading nucleic acids, a prolonged activation can result in cell dormancy or death. To avoid this fate, some archaeal species encode a specialised ring nuclease enzyme (Crn1) to degrade cyclic tetra-adenylate (cA4) and deactivate the ancillary nucleases. Some archaeal viruses and bacteriophage encode a potent ring nuclease anti-CRISPR, AcrIII-1, to rapidly degrade cA4 and neutralise immunity. Homologues of this enzyme (named Crn2) exist in type III CRISPR systems but are uncharacterised. Here we describe an unusual fusion between cA4-activated CRISPR ribonuclease (Csx1) and a cA4-degrading ring nuclease (Crn2) from Marinitoga piezophila. The protein has two binding sites that compete for the cA4 ligand, a canonical cA4-activated ribonuclease activity in the Csx1 domain and a potent cA4 ring nuclease activity in the C-terminal Crn2 domain. The activities of the two constituent enzymes in the fusion protein cooperate to ensure a robust but time-limited cOA-activated ribonuclease activity that is finely tuned to cA4 levels as a second messenger of infection.

Cyclic oligoadenylate (cOA) secondary messengers are generated by type III CRISPR systems in response to viral infection. cOA allosterically activates the CRISPR ancillary ribonucleases Csx1/Csm6, which degrade RNA non-specifically using a HEPN (Higher Eukaryotes and Prokaryotes, Nucleotide binding) active site. This provides effective immunity, but can also lead to growth arrest in infected cells, necessitating a means to deactivate the ribonuclease once viral infection has been cleared. In the crenarchaea, dedicated ring nucleases degrade cA4 (cOA consisting of 4 AMP units), but the equivalent enzyme has not been identified in bacteria. We demonstrate that, in Thermus thermophilus HB8, the uncharacterised protein TTHB144 is a cA4-activated HEPN ribonuclease that also degrades its activator. TTHB144 binds and degrades cA4 at an N-terminal CARF (CRISPR Associated Rossman Fold) domain. The two activities can be separated by site-directed mutagenesis. TTHB144 is thus the first example of a self-limiting CRISPR ribonuclease.