Abstract Plant pathogens secrete proteins, known as effectors, that function in the apoplast or inside plant cells to promote virulence. Effector recognition by cell-surface or cytosolic receptors results in the activation of defence pathways and plant immunity. Despite their importance, our general understanding of fungal effector function and recognition by immunity receptors remains poor. One complication often associated with effectors is their high sequence diversity and lack of identifiable sequence motifs precluding prediction of structure or function. In recent years, several studies have demonstrated that fungal effectors can be grouped into structural classes, despite significant sequence variation and existence across taxonomic groups. Using protein x-ray crystallography, we identify a new structural class of effectors hidden within the secreted in xylem (SIX) effectors from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ( Fol ). The recognised effectors Avr1 (SIX4) and Avr3 (SIX1) represent the founding members of the Fol d ual-domain (FOLD) effector class, with members containing two distinct domains. Using AlphaFold2, we predicted the full SIX effector repertoire of Fol and show that SIX6 and SIX13 are also FOLD effectors, which we validated experimentally for SIX6. Based on structural prediction and comparisons, we show that FOLD effectors are present within three divisions of fungi and are expanded in pathogens and symbionts. Further structural comparisons demonstrate that Fol secretes effectors that adopt a limited number of structural folds during infection of tomato. This analysis also revealed a structural relationship between transcriptionally co-regulated effector pairs. We make use of the Avr1 structure to understand its recognition by the I receptor, which leads to disease resistance in tomato. This study represents an important advance in our understanding of Fol- tomato, and by extension plant-fungal interactions, which will assist the development of novel control and engineering strategies to combat plant pathogens.

Abstract Employing race‐specific resistance genes remains an effective strategy to protect wheat from leaf rust caused by Puccinia triticina (Pt) worldwide, while the newly emerged Pt races, owing to rapid genetic evolution, frequently overcome the immune response delivered by race‐specific resistance genes. The molecular mechanisms underlying the newly evolved virulence Pt pathogen remain unknown. Here, we identified an avirulence protein AvrLr15 from Pt that induced Lr15 ‐dependent immune responses. Heterologously produced AvrLr15 triggered pronounced cell death in Lr15 ‐isogenic wheat leaves. AvrLr15 contains a functional signal peptide, localized to the plant nucleus and cytosol and can suppress BAX‐induced cell death. Evasion of Lr15 ‐mediated resistance in wheat was associated with a deletion and point mutations of amino acids in AvrLr15 rather than AvrLr15 gene loss in the Lr15 ‐breaking Pt races, implying that AvrLr15 is required for the virulence function of Pt. Our findings identified the first molecular determinant of wheat race‐specific immunity and facilitated the identification of the first AVR/R gene pair in the Pt–wheat pathosystem, which will provide a molecular marker to monitor natural Pt populations and guide the deployment of Lr15 ‐resistant wheat cultivars in the field.

Abstract Effectors are a key part of the arsenal of plant pathogenic fungi and promote pathogen virulence and disease. Effectors typically lack sequence similarity to proteins with known functional domains and motifs, limiting our ability to predict their functions and understand how they are recognised by plant hosts. As a result, cross-disciplinary approaches involving structural biology and protein biochemistry are often required to decipher and better characterise effector function. These approaches are reliant on high yields of relatively pure protein, which often requires protein production using a heterologous expression system. For some effectors, establishing an efficient production system can be difficult, particularly those that require multiple disulfide bonds to achieve their naturally folded structure. Here, we describe the use of a co-expression system within the heterologous host E. coli termed CyDisCo (cytoplasmic disulfide bond formation in E. coli ) to produce disulfide bonded fungal effectors. We demonstrate that CyDisCo and a naturalised co-expression approach termed FunCyDisCo (Fungi-CyDisCo) can significantly improve the production yields of numerous disulfide bonded effectors from diverse fungal pathogens. The ability to produce large quantities of functional recombinant protein has facilitated functional studies and crystallisation of several of these reported fungal effectors. We suggest this approach could be useful when investigating the function and recognition of a broad range of disulfide-bond containing effectors.

Abstract The species Brassica rapa is mainly cultivated as a vegetable crop with high economic value. But infectious diseases, such as soft rot disease and clubroot disease can cause severe yield losses. Introducing resistance genes through breeding is an efficient and sustainable way to reduce the susceptibility and improve the yield of crops. Nucleotide-Binding Leucine-Rich Repeat (NLR) genes are the main types of resistance genes. They can recognize pathogen effectors and initiate downstream immune response. However, the intraspecific diversity of NLR genes in Brassica rapa has remained unknown. Based on domain similarity search and machine learning pipeline, we identified 2188 NLRs in 17 accessions of Brassica rapa genomes, which constitute the species-wide pan-NLRome in Brassica rapa . The diversity of the four types of NLR genes are significantly different in the aspects of chromosome location, number stability, integrated domains (IDs), evolutionary trajectory, and positive selection sites. Phylogenetic analyses show TNL-type NLRs whose N terminus contain Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain experienced accession-specific expansion. Moreover, the expanded TNL-type NLRs carry more positively selected amino acid residues which are mainly located on the protein surface based on their 3D structures. These evidences might imply their important biological function in perceiving pathogen effectors. Taken together, our study provides better insights into the diversity and variation of NLR genes in Brassica rapa pangemone, which can facilitate the biofunction assigning, cloning, and subsequent application in breeding programs.