Summary Recent studies on CRISPR ‐based adaptive immune systems have revealed extensive structural and functional diversity of the interference complexes which often coexist intracellularly. The archaeon S ulfolobus islandicus REY 15 A encodes three interference modules, one of type IA and two of type IIIB . Earlier we showed that type IA activity eliminated plasmid vectors carrying matching protospacers with specific CCN PAM sequences. Here we demonstrate that interference‐mediated by one type IIIB module Cmr ‐α, and a Csx 1 protein, efficiently eliminated plasmid vectors carrying matching protospacers but lacking PAM motifs. Moreover, Cmr ‐α‐mediated interference was dependent on directional transcription of the protospacer, in contrast to the transcription‐independent activities of the type IA and type IIIA DNA interference. We infer that the interference mechanism involves transcription‐dependent DNA targeting. A rationale is provided for the intracellular coexistence of the different interference systems in S . islandicus REY 15 A which cooperate functionally by sharing a single Cas 6 protein for crRNA processing and utilize crRNA products from identical CRISPR spacers.

Abstract The gut microbiome (GM) is shaped through infancy and plays a major role in determining susceptibility to chronic inflammatory diseases later in life. Bacteriophages (phages) are known to modulate bacterial populations in numerous ecosystems, including the gut. However, virome data is difficult to analyse because it mostly consists of unknown viruses, i.e. viral dark matter. Here, we manually resolved the viral dark matter in the largest human virome study published to date. Fecal viromes from a cohort of 647 infants at 1 year of age were deeply sequenced and analysed through successive rounds of clustering and curation. We uncovered more than ten thousand viral species distributed over 248 viral families falling within 17 viral order-level clades. Most of the defined viral families and orders were novel and belonged to the Caudoviricetes viral class. Bacterial hosts were predicted for 79% of the viral species using CRISPR spacers, including those in metagenomes from the same fecal samples. While Bacteroides -infecting Crassphages were present, novel viral families were more predominant, including phages infecting Clostridiales and Bifidobacterium . Phage lifestyles were determined for more than three thousand caudoviral species. Lifestyles were homogeneous at the family level for 149 Caudoviricetes families, including 32 families that were found to be virulent, while 117 were temperate. Virulent phage families were more abundant but temperate ones were more diverse and widespread. Together, the viral families found in this study represent a major expansion of existing bacteriophage taxonomy.

Abstract Background Bacteriophages are the most abundant biological entity on the planet, and are key components of any ecosystem they are present in. The gut virome is increasingly being implicated in disease states although these studies largely focus on lytic phages in adults. Here we identify prophages from a large infant cohort and investigate their potential functions. Results We identified 10645 vOTUs from 662 metagenomes. No core virome was found: the most prevalent vOTU was identified in 70% of the samples. The most abundant and prevalent group of phages are a novel group closely related to Bacteroides phage Hanky p00’. Functional annotation of this group revealed the presence of genes in the dDTP-L-rhamnose pathway, possibly involved in the production of capsular polysaccharides. We also found an abundance of diversity generating retroelements in the phages. Additionally, paired virome data allowed us to show that the majority of prophages are induced in at least one sample and that this is not affected by the use of antibiotics in the 4 weeks prior to sampling. Conclusions Prophages in the infant gut are largely unique to the individual and not shared. Most of them appear to be induced and so may be key drivers in shaping the bacterial microbiome. The most abundant group of phages are novel, and possess elements that may allow them to maintain differentially susceptible subpopulations of their host bacterium; whilst also containing diversity generating retroelements that could expand their host range. Prophages are important components of the infant gut that may have far reaching influences on the composition and function of the microbiome.

ABSTRACT Background and aims Necrotizing enterocolitis (NEC) is an acute and life-threatening gastrointestinal disorder afflicting preterm infants, which is currently unpreventable. Fecal microbiota transplantation (FMT) is a promising preventative therapy, but potential side effects raise concern. Removal of bacteria from donor fecal water may reduce side effects while maintaining wanted effects. We aimed to assess preclinical efficacy and safety of bacteria-free fecal filtrate transfer (FFT). Methods Using fecal material from healthy suckling piglets, we administered rectal FMT or cognate FFT by either rectal or oro-gastric administration to formula-fed preterm, cesarean piglets, and compared gut pathology and related safety parameters with saline controls. We then analyzed mucosa and luminal bacterial and viral composition using 16S rRNA gene amplicon and metavirome sequencing, respectively. Finally, we used isolated ileal mucosa, coupled with RNA-Seq, to gauge the host response to the different treatments. Results Oro-gastric FFT eliminated NEC, which was confirmed by microscopy, whereas FMT did not perform better than control. Moreover, FFT but not FMT reduced intestinal permeability, whereas FMT animals had reduced body weight increase and intestinal growth. Oro-gastric FFT increased viral diversity and reduced Proteobacteria abundance in ileal mucosa relative to control. Global gene expression of host mucosa responded to FMT but not FFT with increased and decreased bacterial and viral defense mechanisms, respectively. Conclusions As preterm infants are extremely vulnerable, rational therapies need incontestable safety profiles. Here we show in a clinically relevant animal model that FFT, as opposed to FMT, efficiently prevents NEC without any recognizable side effects. If translatable to preterm infants, this could lead to a change of practice and in turn a reduction in NEC burden.

Abstract Despite the accelerating number of uncultivated virus sequences discovered in metagenomics and their apparent importance for health and disease, the human gut virome and its interactions with bacteria in the gastrointestinal are not well understood. In addition, a paucity of whole-virome datasets from subjects with gastrointestinal diseases is preventing a deeper understanding of the virome’s role in disease and in gastrointestinal ecology as a whole. By combining a deep-learning based metagenomics binning algorithm with paired metagenome and metavirome datasets we developed the Phages from Metagenomics Binning (PHAMB) approach for binning thousands of viral genomes directly from bulk metagenomics data. Simultaneously our methodology enables clustering of viral genomes into accurate taxonomic viral populations. We applied this methodology on the Human Microbiome Project 2 (HMP2) cohort and recovered 6,077 HQ genomes from 1,024 viral populations and explored viral-host interactions. We show that binning can be advantageously applied to existing and future metagenomes to illuminate viral ecological dynamics with other microbiome constituents.

Summary Large cohort studies have contributed significantly to our understanding of the factors that influence the development of the bacterial component of the gut microbiome (GM) during the first years of life. However, the factors that shape the colonization by other important GM members such as the viral fraction remain more elusive. Most gut viruses are bacteriophages (phages), i.e., viruses attacking bacteria in a host specific manner, and to a lesser extent, but also widely present, eukaryotic viruses, including viruses attacking human cells. Here, we utilize the deeply phenotyped COPSAC2010 birth cohort consisting of 700 infants to investigate how social, pre-, peri- and postnatal factors may influence the gut virome composition at one year of age, where fecal virome data was available from 645 infants. Among the different exposures studied, having older siblings and living in an urban vs. rural area had the strongest impact on gut virome composition. Differential abundance analysis from a total of 16,118 viral operational taxonomic units (vOTUs) (mainly phages, but also 6.1% eukaryotic viruses) identified 2,105 vOTUs varying with environmental exposures, of which 5.9% were eukaryotic viruses and the rest was phages. Bacterial hosts for these phages were mainly predicted to be within the Bacteroidaceae, Prevotellaceae , and Ruminococcaceae families, as determined by CRISPR spacer matches. Spearman correlation coefficients indicated strong co-abundance trends of vOTUs and their targeted bacterial host, which underlined the predicted phage-host connections. Further, our findings show that some gut viruses encode important metabolic functions and how the abundance of genes encoding these functions is influenced by environmental exposures. Genes that were significantly associated with early life exposures were found in a total of 42 vOTUs. 18 of these vOTUs had their life styles predicted, with 17 of them having a temperate lifestyle. These 42 vOTUs carried genes coding for enzymes involved in alanine, aspartate and glutamate metabolism, glycolysis-gluconeogenesis, as well as fatty acid biosynthesis. The latter implies that these phages could be involved in the utilization and degradation of major dietary components and affect infant health by influencing the metabolic capacity of their bacterial host. Given the importance of the GM in early life for maturation of the immune system and maintenance of metabolic health, these findings provide a valuable source of information for understanding early life factors that predispose for autoimmune and metabolic disorders.

Abstract Many prokaryotes harbor the adaptive CRISPR-Cas system, which stores small nucleotide fragments from previous invasions of nucleic acids via viruses or plasmids. This molecular archive blocks further invaders carrying identical or similar nucleotide sequences. However, very few of these systems have been experimentally confirmed to be active in gut bacteria. Here, we experimentally demonstrate that the type I-C CRISPR-Cas system of the prevalent gut bacterium Eggerthella lenta can specifically target and cleave foreign DNA in vitro by using a plasmid transformation assay. We also show that the CRISPR-Cas system acquires new immunities (spacers) from the genome of a virulent E. lenta phage using traditional phage-assays in vitro but also in vivo using gnotobiotic (GB) mice. An increased number of spacer acquisition events were observed when E. lenta was exposed to a low multiplicity of infection in vitro , and three phage genes were found to contain protospacer hotspots. Interestingly, much less new spacer acquisitions were detected in vivo than in vitro . Longitudinal analysis of phage-bacteria interactions showed sustained coexistence in the gut of GB mice, with phage abundance being approximately one log higher than the bacteria. Our findings show that while the type I-C CRISPR-Cas system is active in vitro and in vivo , a highly virulent phage in vitro was still able co-exist with its bacterial host in vivo . Taken altogether, our results suggest that the CRISPR-Cas defense system of E. lenta provides only partial immunity in the gut.

Background: Bacterial vaginosis (BV) is characterised by a reduction in Lactobacillus spp. abundance and increased abundance of facultative anaerobes, like Gardnerella vaginalis. BV aetiology is not fully understood, but bacteriophages could play a pivotal role causing perturbation of the vaginal bacterial community. Here we investigate the vaginal viral community, including bacteriophages, and its association to the bacterial community and BV-status. Methods: Vaginal samples from 48 patients undergoing IVF treatment for non-female factor infertility were subjected to metagenomic sequencing of purified virus-like particles. The vaginal viral community was characterized and correlated with BV-status, bacterial community structure and presence of key vaginal bacterial species. Results: The majority of identified vaginal viruses belonged to the class of double-stranded DNA bacteriophages, with eukaryotic viruses constituting 4% of total reads. Clear links between viral community composition and BV (q = 0.006, R = 0.26) as well as presence of L. crispatus (q = 0.001, R = 0.43), L. iners, Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae were found (q < 0.002, R > 0.15). Interestingly, also the eukaryotic viral community was correlated with BV-status (q = 0.018, R = 0.20). Conclusions: The vaginal virome is clearly linked with bacterial community structure and BV-status. Clinical Trials Registration: [NCT02042352][1]. Keywords: Vaginal microbiome; Vaginal virome; Bacteriophages; Bacterial vaginosis; Dysbiosis. [1]: /lookup/external-ref?link_type=CLINTRIALGOV&access_num=NCT02042352&atom=%2Fbiorxiv%2Fearly%2F2019%2F09%2F07%2F755710.atom

species are potential pathogens that can contaminate powdered infant formula.

Abstract Prokaryotic viruses express anti-CRISPR (Acr) proteins to inhibit the host adaptive immune system, CRISPR-Cas. While the virus infection biology was shown to be strongly dependent on the relative strengths of the host CRISPR-Cas and viral Acrs, little is known about the role of the core processes of viral life cycle (replication, packaging etc) in defence/anti-defence arms race. Here, we demonstrate the selective advantage provided by a replication initiator, Rep, in the context of CRISPR-Acr interactions. First, we developed a two-host based CRISPR-Cas genome editing tool for the deletion of highly conserved and thus potentially important viral genes. Using this strategy, we deleted a highly conserved Rep-coding gene, gp16 , from the genome of Sulfolobus islandicus rod-shaped virus 2 (SIRV2). The knockout mutant (Δ gp16 ) produced around 4 fold less virus in a CRISPR-null host, suggesting that Rep is the major contributor to replication initiation in Rudiviridae. Indeed, DNA sequencing revealed Rep-dependent replication initiation from the viral genome termini, in addition to Rep-independent replication initiation from non-terminal sites. Intriguingly, the lack of Rep showed a profound effect on virus propagation in a host carrying CRISPR-Cas immunity. Accordingly, the co-infecting parental virus ( rep -containing) outcompeted the Δ gp16 mutant much more quickly in CRISPR-containing host than in CRISPR-null host, demonstrating a selective advantage provided by Rep in the presence of host CRISPR-Cas immunity. Despite the non-essentiality, rep is carried by all known members of Rudiviridae, which is likely an evolutionary outcome driven by the ubiquitous presence of CRISPR-Cas in Sulfolobales. Importance CRISPR-Cas and anti-CRISPR proteins are accessary to prokaryotes and their viruses respectively. To date, research has been focused on their diversity, molecular mechanisms and application in genome editing. How CRISPR-Acr arms race influence the evolution of viral core genes involved in the basic virus life cycle remained a gap of knowledge so far. This study provides the first evidence that CRISPR-Acr arms race poses a selection pressure on the efficiency of viral genome replication, forcing viruses to evolve highly productive replication machineries..