ABSTRACT Somatic mutations in cancer genes have been ubiquitously detected in clonal expansions across healthy human tissue, including in clonal hematopoiesis. However, mutated and wildtype cells are morphologically and phenotypically similar, limiting the ability to link genotypes with cellular phenotypes. To overcome this limitation, we leveraged multi-modality single-cell sequencing, capturing the mutation with transcriptomes and methylomes in stem and progenitors from individuals with DNMT3A R882 mutated clonal hematopoiesis. DNMT3A mutations resulted in myeloid over lymphoid bias, and in expansion of immature myeloid progenitors primed toward megakaryocytic-erythroid fate. We observed dysregulated expression of lineage and leukemia stem cell markers. DNMT3A R882 led to preferential hypomethylation of polycomb repressive complex 2 targets and a specific sequence motif. Notably, the hypomethylation motif is enriched in binding motifs of key hematopoietic transcription factors, serving as a potential mechanistic link between DNMT3A R882 mutations and aberrant transcriptional phenotypes. Thus, single-cell multi-omics pave the road to defining the downstream consequences of mutations that drive human clonal mosaicism.

Summary The bone marrow permanently harbors high numbers of neutrophils, and a tumor-supportive bias of these cells could significantly impact bone marrow-confined malignancies. In multiple myeloma, the bone marrow is characterized by inflammatory stromal cells with the potential to influence neutrophils. We investigated myeloma-associated alterations in marrow neutrophils and the impact of stromal inflammation on neutrophil function. Mature neutrophils in myeloma marrow are activated and tumor-supportive, transcribing increased levels of IL-1β, and myeloma cell survival factor BAFF. Interactions with inflammatory stromal cells can induce neutrophil activation, including BAFF secretion, in a STAT3-dependent manner and once activated, neutrophils gain the ability to reciprocally induce stromal activation. After first-line myeloid-depleting treatment, patient bone marrow retains residual stromal inflammation and newly-formed neutrophils are reactivated. Combined, we identify a neutrophil-stromal cell feed-forward loop driving tumor-supportive inflammation that persists after treatment and warrants novel strategies to target both stromal and immune microenvironments in multiple myeloma.

Abstract Natural killer (NK) cells mediate the cytotoxic immune response against multiple myeloma and are important effector cells in immune therapies through antibody-dependent cellular cytotoxicity. Here, we used single-cell transcriptomics, flow cytometry and functional assays to investigate the bone marrow NK cell compartment of myeloma patients at diagnosis, during treatment and after relapse. The bone marrow of myeloma patients is characterized by a reduction in conventional cytotoxic NK cells that persists throughout treatment. We show in 20% of newly diagnosed myeloma patients that an altered balance between cytotoxic and cytokine-producing NK cells translates into a reduced cytotoxic ability in response to therapeutic antibodies. The relative loss of cytotoxic NK cells persists at relapse and is accompanied by an expansion of IFN-responsive NK cells. These findings reveal previously unappreciated alterations in bone marrow NK cell composition and highlight the importance of understanding the bone marrow immune system in patients receiving immunotherapies. Statement of significance The bone marrow of multiple myeloma patients is characterized by a persistent reduction in cytotoxic CD56 dim NK cells, accompanied by inferior in vitro responses to therapeutic antibodies at diagnosis and an increase in IFN-responsive NK cells at relapse. These findings highlight the importance of understanding the BM microenvironment in multiple myeloma patients receiving immunotherapies.

Abstract Multiple myeloma is a disease of malignant plasma cells residing in the bone marrow, where interactions with local immune cells are thought to contribute to disease pathobiology. However, since a multiple myeloma diagnosis is virtually always preceded by an asymptomatic precursor phase, identifying early alterations in the bone marrow micro-environment following occupation by multiple myeloma cells remains challenging. Here we used the 5TGM1 transfer model of murine myeloma in combination with myeloma-permissive KaLwRij mice and myeloma-resistant C57Bl/6 mice and hypothesized that differential sensitivity to myeloma in these HLA-identical mouse strains has an immunological basis and might allow for dissection of early immune responses to myeloma cells. Using flow cytometry and single-cell RNA sequencing we show that C57Bl/6 mice can restrain tumor growth for prolonged periods, associated with activation of cytotoxic immune responses that were absent from KaLwRij mice. Transcriptional analysis of immune cells and stromal cells identified a central role for IFN-signaling in tumor containment, and antibody-mediated neutralization of IFNγ increased both incidence and outgrowth of multiple myeloma in C57Bl/6 mice. Together these findings highlight the ability of a fully functional immune system to control multiple myeloma progression in an IFNγ−dependent manner and suggest that transfer of 5TGM1 cells into parental C57Bl/6 mice can serve as a faithful model to track anti-myeloma immune responses in immune competent and genetically modifiable mice.

Abstract Malignant plasma cells in multiple myeloma patients reside in the bone marrow and continuously interact with local immune cells. Progression and therapy response are influenced by this immune environment, highlighting the need for a detailed understanding of endogenous immune responses to malignant plasma cells. Here we used the 5TGM1 murine transfer model of multiple myeloma to dissect early immune responses to myeloma cells. We modeled stable and progressive disease by transferring 5TGM1 murine myeloma cells into C57Bl/6 mice and KaLwRij mice, respectively. We used flow cytometry and single‐cell and bulk transcriptomic analyses to characterize differential immune responses in stable and progressive disease. Transfer of 5TGM1 cells in C57Bl/6 mice led to stable disease with low tumor burden in a subset of animals. Stable disease was associated with sustained activation and expansion of NK cells, ILC1, and CD8 + T cells, a response that was lost upon disease progression. Single‐cell RNA‐sequencing of immune cells and bulk RNA sequencing of immune and mesenchymal stromal cells implicated the activation of interferon responses as a central immune pathway during stable disease. Experimentally, neutralization of IFNγ significantly increased myeloma development and progression in C57Bl/6 mice, testifying to the importance of this pathway in early disease control. In conclusion, we provide a framework for studying immune responses to multiple myeloma progression in immunocompetent and genetically modifiable mice and highlight the importance of bone marrow immunity in tumor control.