Butterflies and moths (Lepidoptera) are one of the major superradiations of insects, comprising nearly 160,000 described extant species. As herbivores, pollinators, and prey, Lepidoptera play a fundamental role in almost every terrestrial ecosystem. Lepidoptera are also indicators of environmental change and serve as models for research on mimicry and genetics. They have been central to the development of coevolutionary hypotheses, such as butterflies with flowering plants and moths’ evolutionary arms race with echolocating bats. However, these hypotheses have not been rigorously tested, because a robust lepidopteran phylogeny and timing of evolutionary novelties are lacking. To address these issues, we inferred a comprehensive phylogeny of Lepidoptera, using the largest dataset assembled for the order (2,098 orthologous protein-coding genes from transcriptomes of 186 species, representing nearly all superfamilies), and dated it with carefully evaluated synapomorphy-based fossils. The oldest members of the Lepidoptera crown group appeared in the Late Carboniferous (∼300 Ma) and fed on nonvascular land plants. Lepidoptera evolved the tube-like proboscis in the Middle Triassic (∼241 Ma), which allowed them to acquire nectar from flowering plants. This morphological innovation, along with other traits, likely promoted the extraordinary diversification of superfamily-level lepidopteran crown groups. The ancestor of butterflies was likely nocturnal, and our results indicate that butterflies became day-flying in the Late Cretaceous (∼98 Ma). Moth hearing organs arose multiple times before the evolutionary arms race between moths and bats, perhaps initially detecting a wide range of sound frequencies before being co-opted to specifically detect bat sonar. Our study provides an essential framework for future comparative studies on butterfly and moth evolution.

Abstract Butterflies are a diverse and charismatic insect group that are thought to have diversified via coevolution with plants and in response to dispersals following key geological events. These hypotheses have been poorly tested at the macroevolutionary scale because a comprehensive phylogenetic framework and datasets on global distributions and larval hosts of butterflies are lacking. We sequenced 391 genes from nearly 2,000 butterfly species to construct a new, phylogenomic tree of butterflies representing 92% of all genera and aggregated global distribution records and larval host datasets. We found that butterflies likely originated in what is now the Americas, ∼100 Ma, shortly before the Cretaceous Thermal Maximum, then crossed Beringia and diversified in the Paleotropics. The ancestor of modern butterflies likely fed on Fabaceae, and most extant families were present before the K/Pg extinction. The majority of butterfly dispersals occurred from the tropics (especially the Neotropics) to temperate zones, largely supporting a “cradle” pattern of diversification. Surprisingly, host breadth changes and shifts to novel host plants had only modest impacts.

Abstract Insect silk is an incredibly versatile biomaterial. Lepidoptera and their sister lineage, Trichoptera, display some of the most diverse uses of silk with varying strength, adhesive qualities and elastic properties. It is well known that silk fibroin genes are long (> 20 kb) and have many repetitive motifs. These features make these genes challenging to sequence. Most research thus far has focused on conserved N- and C-terminal regions of fibroin genes because a full comparison of repetitive regions across taxa has not been possible. Using the PacBio Sequel II system and SMRT sequencing, we generated high fidelity (HiFi) long-read genomic and transcriptomic sequences for the Indianmeal moth ( Plodia interpunctella ) and genomic sequences for the caddisfly, Eubasilissa regina . Both genomes were highly contiguous (N50 = 9.7 Mbp/32.4 Mbp, L50 = 13/11) and complete (BUSCO Complete = 99.3%/95.2%), with complete and contiguous recovery of silk heavy fibroin gene sequences. This study demonstrates that HiFi long-read sequencing can significantly help our understanding of genes with highly contiguous, repetitive regions.

Abstract Animals shift activity periods to reduce predation, minimize competition, or exploit new resources, and this can drive sensory system evolution. But adaptive mechanisms underlying niche- shifts are poorly understood, and model organisms are often too distantly related to reveal the genetic drivers. To address this, we examined expression patterns between two closely related silk moths that have undergone temporal niche divergence. We found 200-700 differentially expressed genes, including day upregulation in eye development and visual processing genes, and night upregulation of antennal and olfactory brain development genes. Further, clusters of circadian, sensory, and brain development genes co-expressed with diel-activity. In both species, eight genes showed expression significantly correlated to diel activity, and are involved in vision, olfaction, brain development, neural plasticity, energy utilization, and cellular maintenance. We repeatedly recovered disco , a zinc- finger transcription factor involved in antennal development, circadian activity, and optic lobe brain development in flies. While disco mutants have circadian arrhythmia, most studies attribute this to improper clock neuron development, not adult circadian maintenance. Comparing predicted 3D protein structure across moth and fly genetic models revealed disco likely retained developmental function with a conserved zinc finger domain, but gained functional zinc finger domains absent in D. melanogaster. These regions have several mutations between nocturnal and diurnal species that co- occur with higher levels of predicted phosphorylation sites. With robust circadian expression, functional nocturnal and diurnal mutations, and structural and sequence conservation, we hypothesize that disco may be a master regulator contributing to diel-activity diversification in adult moths. Significance Insect diel-activity patterns are diverse, yet the underlying evolutionary processes are poorly understood. Light environment powerfully entrains circadian rhythms and drives diel-niche and sensory evolution. To investigate its impact, we compared gene expression in closely related day- and night-active wild silk moths, with otherwise similar ecologies. Expression patterns that varied with diel activity included genes linked to eye development, neural plasticity and cellular maintenance. Notably, disco , which encodes a zinc-finger transcription factor involved in pupal Drosophila optic lobe and antennal development, shows robust adult circadian mRNA cycling in moth heads, is highly conserved in moths, and has additional zinc-finger domains with specific nocturnal and diurnal mutations. We hypothesize that disco may contribute to diversification of adult diel-activity patterns in moths.

ABSTRACT Lepidopteran silks are produced during the larval stage and are used for mobility and protection from predators, parasitoids, and pathogens. Our knowledge of silk structure and production in Lepidoptera is based largely on the biology of the domestic silk moth ( Bombyx mori ), but recent comparative evidence suggests that silk production and structure vary widely across moth taxa. Some species like the Indian meal moth ( Plodia interpunctella ) are becoming important biological models to study silk for its potential application to materials science and medicine, but many aspects of silk production in this species remain unknown. Here we characterize the silk of P. interpunctella by measuring the width of wandering and pupal silk strands and find that pupal silk is significantly thicker than the latter. We then report individual variation in pupal silk production in our lab-reared colony with a very small number of individuals forgoing pupal silk (< 4%) and find that overcrowding had no effect on this, whereas exposure to elevated temperatures reduced rates of pupal silk production.