Abstract Bacterial cell division is a tightly regulated process that requires the formation of a dynamic multi-protein complex. In the Firmicutes phylum, GpsB is a membrane associated protein that coordinates peptidoglycan synthesis for cell growth and division. Although GpsB has been studied in several organisms, the structure, function, and interactome of Staphylococcus aureus GpsB is largely uncharacterized, despite being reported as uniquely essential for growth in this clinically relevant bacterium. To address this knowledge gap, we solved the crystal structure of the N-terminal domain of S. aureus GpsB. This structure reveals an atypical asymmetric dimer, and major conformational flexibility that can be mapped to a hinge region formed by a three-residue insertion exclusive to Staphylococci . When this three-residue insertion is excised, its thermal stability increases, and the mutant no longer produces a previously reported lethal phenotype when overexpressed in Bacillus subtilis . Furthermore, we provide the first biochemical, biophysical, and crystallographic evidence that the N-terminal domain of GpsB binds not only PBP4, but also FtsZ, through a conserved recognition motif located on their C-terminus, thus linking peptidoglycan synthesis with cell division. Taken together, the unique structure of S. aureus GpsB and its direct interaction with FtsZ/PBP4 provide deeper insight into the central role of GpsB in S. aureus cell division.

Abstract When eukaryotic cells are killed by pathogenic microorganisms, damage-associated and pathogen-associated signals are generated that alert other cells of nearby danger. Bacteria can detect the death of their kin; however, how bacteria make threat assessments of cellular injury is largely unexplored. Here we show that polyamines released by lysed bacteria serve as damage-associated molecules in Pseudomonas aeruginosa . In response to exogenous polyamines, Gac/Rsm and cyclic-di-GMP signaling is activated and intracellular polyamine levels increase. In the absence of a threat, polyamines are catabolized, and intracellular polyamines return to basal levels, but cells infected by bacteriophage increase and maintain intracellular polyamine levels, which inhibits phage replication. Phage species not inhibited by polyamines did not trigger polyamine accumulation by P. aeruginosa , suggesting polyamine accumulation and metabolism are targets in the phage-host arms-race. Our results suggest that like eukaryotic cells, bacteria can differentiate damage-associated and pathogen-associated signals to make threat assessments of cellular injury. Abstract Figure

ABSTRACT Bacterial cell division is a complex and highly regulated process requiring the coordination of many different proteins. Despite substantial work in model organisms, our understanding of the systems regulating cell division in non-canonical organisms, including critical human pathogens, is far from complete. One such organism is Staphylococcus aureus , a spherical bacterium that lacks known cell division regulatory proteins. Recent studies on GpsB, a protein conserved within the Firmicutes phylum, have provided insight into cell division regulation in S. aureus and other related organisms. It has been revealed that GpsB coordinates cell division and cell wall synthesis in multiple species by interacting with Penicillin Binding Proteins (PBPs) and other partners. In S. aureus , we have previously shown that GpsB directly regulates FtsZ polymerization. In this study, using Bacillus subtilis as a tool, we isolated intragenic and extragenic spontaneous suppressor mutants that abrogate the lethality of S. aureus GpsB overproduction in B. subtilis . Through characterization of these mutants, we identified several key residues important for the function of GpsB. Furthermore, we discovered an additional role for GpsB in wall teichoic acid (WTA) biosynthesis in S. aureus . Specifically, we show that GpsB directly interacts with the wall teichoic acid export protein TarG using a bacterial two-hybrid analysis. We also identified a three-residue motif in GpsB that is crucial for this interaction. Based on the analysis of the localization of TagG in B. subtilis and its homolog TarG in S. aureus , it appears that WTA machinery is a part of the divisome complex. As such, we show additional evidence to the growing body of work that suggests that along with peptidoglycan synthesis, WTA biosynthesis and export may take place at the site of cell division. Taken together, this research illustrates how GpsB performs an essential function in S. aureus by directly linking the tightly regulated cell cycle processes of cell division and WTA-mediated cell surface decoration. IMPORTANCE/AUTHOR SUMMARY Cytokinesis in bacteria involves an intricate orchestration of several key cell division proteins and other factors involved in building a robust cell envelope. One of the key factors that differentiates Gram-positive bacteria from Gram-negative bacteria is the presence of teichoic acids interlaced within the Gram-positive cell wall. By characterizing the role of Staphylococcus aureus GpsB, an essential cell division protein in this organism, we have uncovered an additional role for GpsB in wall teichoic acids (WTA) biosynthesis. We show that GpsB directly interacts with TarG of the WTA export complex. We also show this function of GpsB may be conserved in other GpsB homologs as GpsB and the WTA exporter complex follow similar localization patterns. It has been suggested that WTA acts as a molecular signal to control the activity of autolytic enzymes, especially during the separation of conjoined daughter cells. Thus, our results reveal that GpsB, in addition to playing a role in cell division, may also help coordinate WTA biogenesis.

Abstract The bacterial division and cell wall ( dcw ) cluster is a highly conserved region of the genome which encodes several essential cell division factors including the central divisome protein FtsZ. Understanding the regulation of this region is key to our overall understanding of the division process. mraZ is found at the 5’ end of the dcw cluster and previous studies have described MraZ as a sequence-specific DNA binding protein. In this article, we investigate MraZ to elucidate its role in Bacillus subtilis . Through our investigation, we demonstrate that increased levels of MraZ result in lethal filamentation due to repression of its own operon ( mraZ - mraW - ftsL - pbpB ). We observe rescue of filamentation upon decoupling ftsL expression, but not other genes in the operon, from MraZ control. Furthermore, through timelapse microscopy we were able to identify that overexpression of mraZ , results in de-condensation of the FtsZ ring (Z-ring). This is likely due to depletion of FtsL, and thus, we believe the precise role of FtsL is likely in Z-ring maturation and promotion of subsequent treadmilling. Our data suggests that regulation of the mra operon may be an alternative way for cells to quickly arrest cytokinesis potentially during entry into stationary phase and in the event of DNA replication arrest.

ABSTRACT Antibiotic stewardship is of paramount importance to limit the emergence of antibiotic-resistant bacteria in not only hospital settings, but also in animal husbandry, aquaculture, and agricultural sectors. Currently, large quantities of antibiotics are applied to treat agricultural diseases like citrus greening disease (CGD). The two commonly used antibiotics approved for this purpose are streptomycin and oxytetracycline. Although investigations are ongoing to understand how efficient this process is to control the spread of CGD, to our knowledge, there have been no studies that evaluate the effect of environmental factors such as sunlight on the efficacy of the above-mentioned antibiotics. We conducted a simple disc-diffusion assay to study the efficacy of streptomycin and oxytetracycline after exposure to sunlight for 7- or 14-day periods using Escherichia coli and Bacillus subtilis as the representative strains of Gram-negative and Gram-positive organisms respectively. Freshly prepared discs and discs stored in the dark for 7 or 14 days served as our controls. We show that the antibiotic potential of oxytetracycline exposed to sunlight dramatically decreases over the course of 14 days against both E. coli and B. subtilis . However, the effectiveness of streptomycin was only moderately impacted by sunlight. It is important to note that antibiotics that last longer in the environment may play a deleterious role in the rise and spread of antibiotic-resistant bacteria. Further studies are needed to substantively analyze the safety and efficacy of antibiotics used for broader environmental applications. IMPORTANCE Although antibiotics have been used for agricultural purposes for decades, due to the rapid rise in antibiotic resistance this usage needs to be revisited. Questions remain on the appropriate mode of application of antibiotics and the actual benefits of using antibiotics for treating the infections caused by plant pathogens, especially for the ones that are intracellular in nature. Here we show that the two commonly used commercial antibiotics, oxytetracycline and streptomycin, lose their efficacy at different rates in the presence of sunlight. While the former loses its potency within days the latter remains active for many days. Thus, oxytetracycline may not be active long enough to produce desired effect and streptomycin may persist in the environment and as a side effect due to its selective pressure, may force the rise of streptomycin-resistant pathogens.

Abstract β-Lactam antibiotics, particularly cephalosporins, are major risk factors for C. difficile infection (CDI), the most common hospital acquired infection. These broad-spectrum antibiotics irreversibly inhibit penicillin-binding proteins (PBPs), essential enzymes that assemble the bacterial cell wall. Little is known about the C. difficile PBPs, yet they play central roles in the growth, infection, and transmission of this pathogen. In this study we discover that PBP2, essential for vegetative growth, is the primary bactericidal target for β-lactams in C. difficile . We further demonstrate PBP2 is insensitive to cephalosporin inhibition, revealing a key cause of the well-documented, but poorly understood, cephalosporin resistance in C. difficile . For the first time, we determine the crystal structures of C. difficile PBP2, which bears several highly unique features, including significant ligand-induced conformational changes and an active site Zn 2+ -binding motif that influences β-lactam binding and protein stability. Remarkably, this motif is shared in two other C. difficile PBPs essential for sporulation, PBP3 and SpoVD. While these PBPs are present in a wide range of bacterial taxa, including species in extreme environments and the human gut, they are mostly found in anaerobes, typically Firmicutes. The widespread presence of this convergently evolved thiol-containing motif and its cognate Zn 2+ suggests it may function as a redox-sensor to regulate cell wall synthesis for survival in adverse environments. Collectively, our findings address important etiological questions surrounding C. difficile , characterize new elements of PBP structure and function, and lay the groundwork for antibiotic development targeting both C. difficile growth and sporulation.

The concept of bacterial dark matter stems from our inability to culture most microbes and represents a fundamental hole in our knowledge of microbial diversity. Herein we present the domestication of such an organism: a previously uncultured, novel species from the rare-Actinomycetes genus Verrucosispora . Although initial recovery took >4 months, isolation of phenotypically distinct, domesticated generations occurred within weeks. Two isolates were subjected to phenogenomic analyses, revealing domestication correlated with enhanced growth rates in nutrient-rich media, but diminished capacity to metabolize diverse amino acids. This is seemingly mediated by genomic decay through the pseudogenization of amino acids metabolism genes. Conversely, later generational strains had enhanced spore germination rates, potentially through the reversion of a sporulation-associated kinase from pseudogene to true gene status. We observed that our most wild-type isolate had the greatest potential for antibacterial activity, which correlated with extensive mutational attrition of biosynthetic gene clusters in domesticated strains. Comparative analyses revealed wholesale genomic reordering in strains, with widespread SNP, indel and pseudogene mutations observed. We hypothesize that domestication of this previously unculturable organism resulted from the shedding of genomic flexibility required for life in a dynamic marine environment, parsing out genetic redundancy to allow for a newfound cultivable amenability.

Bacteria adapt to different environments by regulating cell division and several conditions that modulate cell division have been documented. Understanding how bacteria transduce environmental signals to control cell division is critical to comprehend the global network of cell division regulation. In this article we describe a role for Bacillus subtilis YpsA, an uncharacterized protein of the SLOG superfamily of nucleotide and ligand-binding proteins, in cell division. We observed that YpsA provides protection against oxidative stress as cells lacking ypsA show increased susceptibility to hydrogen peroxide treatment. We found that increased expression of ypsA leads to cell division inhibition due to defective assembly of FtsZ, the tubulin-like essential protein that marks the sites of cell division. We showed that cell division inhibition by YpsA is linked to glucose availability. We generated YpsA mutants that are no longer able to inhibit cell division. Finally, we show that the role of YpsA is possibly conserved in Firmicutes, as overproduction of YpsA in Staphylococcus aureus also impairs cell division. Therefore, we propose ypsA to be renamed as iodA for inhibitor of division.

Although many bacterial cell division factors have been uncovered over the years, evidence from recent studies points to the existence of yet to be discovered factors involved in cell division regulation. Thus, it is important to identify factors and conditions that regulate cell division to obtain a better understanding of this fundamental biological process. We recently reported that in the Gram-positive organisms Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus , increased production of YpsA resulted in cell division inhibition. In this study, we isolated spontaneous suppressor mutations to uncover critical residues of YpsA and the pathways through which YpsA may exert its function. Using this technique, we were able to isolate four unique intragenic suppressor mutations in ypsA (E55D, P79L, R111P, G132E) that rendered the mutated YpsA non-toxic upon overproduction. We also isolated an extragenic suppressor mutation in yfhS, a gene that encodes a protein of unknown function. Subsequent analysis confirmed that cells lacking yfhS were unable to undergo filamentation in response to YpsA overproduction. We also serendipitously discovered that YfhS may play a role in cell size regulation.

Abstract Acinetobacter baumannii is a formidable opportunistic pathogen that is notoriously difficult to eradicate from hospital settings and can spread quickly via healthcare personnel despite preventive measures. This resilience is often attributed to a proclivity for biofilm formation, which grants A. baumannii a higher tolerance towards external stress, desiccation, and antimicrobials. Despite this, little is known regarding the mechanisms orchestrating A. baumannii biofilm formation. Herein, we performed RNA-seq on biofilm and planktonic populations for the multidrug resistant isolate, AB5075, and identified 438 genes with altered expression. To assess the potential role of genes upregulated within biofilms, we tested the biofilm forming capacity of their respective mutants from an A. baumannii transposon library. In so doing, we uncovered 24 genes whose disruption led to reduced biofilm formation. One such element, cold shock protein C ( cspC ), produced a mucoidal, non-mucoviscous colony phenotype. RNA-sequencing of this mutant revealed the down regulation of pili and fimbriae in the cspC mutant, which would explain the decreased biofilm observed. Using MIC assays, we note that the mutant displayed increased antibiotic tolerance that we hypothesize is mediated by overexpression of multi-drug efflux pumps and altered mRNA stability of their corresponding transcriptional repressor. Finally, we show that CspC is required for survival during oxidative stress and challenge by the human immune system, and plays a pivotal role during systemic infection. Collectively, our work identifies a cadre of new biofilm associated genes within A. baumannii and provides insight into the global regulatory network of this emerging human pathogen.