Viral genome sequencing has guided our understanding of the spread and extent of genetic diversity of SARS-CoV-2 during the COVID-19 pandemic. SARS-CoV-2 viral genomes are usually sequenced from nasopharyngeal swabs of individual patients to track viral spread. Recently, RT-qPCR of municipal wastewater has been used to quantify the abundance of SARS-CoV-2 in several regions globally. However, metatranscriptomic sequencing of wastewater can be used to profile the viral genetic diversity across infected communities. Here, we sequenced RNA directly from sewage collected by municipal utility districts in the San Francisco Bay Area to generate complete and nearly complete SARS-CoV-2 genomes. The major consensus SARS-CoV-2 genotypes detected in the sewage were identical to clinical genomes from the region. Using a pipeline for single nucleotide variant calling in a metagenomic context, we characterized minor SARS-CoV-2 alleles in the wastewater and detected viral genotypes which were also found within clinical genomes throughout California. Observed wastewater variants were more similar to local California patient-derived genotypes than they were to those from other regions within the United States or globally. Additional variants detected in wastewater have only been identified in genomes from patients sampled outside California, indicating that wastewater sequencing can provide evidence for recent introductions of viral lineages before they are detected by local clinical sequencing. These results demonstrate that epidemiological surveillance through wastewater sequencing can aid in tracking exact viral strains in an epidemic context.

Variants of microRNAs (miRNAs), called isomiRs, are commonly reported in deep-sequencing studies; however, the functional significance of these variants remains controversial. Observational studies show that isomiR patterns are non-random, hinting that these molecules could be regulated and therefore functional, although no conclusive biological role has been demonstrated for these molecules. To assess the biological relevance of isomiRs, we have performed ultra-deep miRNA-seq on ten adult human tissues, and created an analysis pipeline called miRNA-MATE to align, annotate, and analyze miRNAs and their isomiRs. We find that isomiRs share sequence and expression characteristics with canonical miRNAs, and are generally strongly correlated with canonical miRNA expression. A large proportion of isomiRs potentially derive from AGO2 cleavage independent of Dicer. We isolated polyribosome-associated mRNA, captured the mRNA-bound miRNAs, and found that isomiRs and canonical miRNAs are equally associated with translational machinery. Finally, we transfected cells with biotinylated RNA duplexes encoding isomiRs or their canonical counterparts and directly assayed their mRNA targets. These studies allow us to experimentally determine genome-wide mRNA targets, and these experiments showed substantial overlap in functional mRNA networks suppressed by both canonical miRNAs and their isomiRs. Together, these results find isomiRs to be biologically relevant and functionally cooperative partners of canonical miRNAs that act coordinately to target pathways of functionally related genes. This work exposes the complexity of the miRNA-transcriptome, and helps explain a major miRNA paradox: how specific regulation of biological processes can occur when the specificity of miRNA targeting is mediated by only 6 to 11 nucleotides.

Mobile group II introns encode reverse transcriptases (RTs) that function in intron mobility (“retrohoming”) by a process that requires reverse transcription of a highly structured, 2–2.5-kb intron RNA with high processivity and fidelity. Although the latter properties are potentially useful for applications in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing (RNA-seq), group II intron RTs have been difficult to purify free of the intron RNA, and their utility as research tools has not been investigated systematically. Here, we developed general methods for the high-level expression and purification of group II intron-encoded RTs as fusion proteins with a rigidly linked, noncleavable solubility tag, and we applied them to group II intron RTs from bacterial thermophiles. We thus obtained thermostable group II intron RT fusion proteins that have higher processivity, fidelity, and thermostability than retroviral RTs, synthesize cDNAs at temperatures up to 81°C, and have significant advantages for qRT-PCR, capillary electrophoresis for RNA-structure mapping, and next-generation RNA sequencing. Further, we find that group II intron RTs differ from the retroviral enzymes in template switching with minimal base-pairing to the 3′ ends of new RNA templates, making it possible to efficiently and seamlessly link adaptors containing PCR-primer binding sites to cDNA ends without an RNA ligase step. This novel template-switching activity enables facile and less biased cloning of nonpolyadenylated RNAs, such as miRNAs or protein-bound RNA fragments. Our findings demonstrate novel biochemical activities and inherent advantages of group II intron RTs for research, biotechnological, and diagnostic methods, with potentially wide applications.

Abstract The use of blood-based extracellular RNA (cell-free RNA; exRNA) as clinical biomarker requires the implementation of a validated procedure for sample collection, processing, and profiling. So far, no study has systematically addressed the pre-analytical variables affecting transcriptome analysis of exRNAs. In the exRNAQC study, we evaluated ten blood collection tubes, three time intervals between blood draw and downstream processing, and eight RNA purification methods using the supplier-specified minimum and maximum biofluid input volumes. The impact of these pre-analytics on deep transcriptome profiling of both small and messenger RNA from healthy donors’ plasma or serum was assessed for each pre-analytical variable separately and for interactions between a selected set of pre-analytics, resulting in 456 extracellular transcriptomes. Making use of 189 synthetic spike-in RNAs, the processing and analysis workflow was controlled. When comparing blood collection tubes, so-called preservation tubes do not stabilize exRNA well, and result in variable RNA concentration and sensitivity (i.e., the number of detected RNAs) over time, as well as compromised reproducibility. We also document large differences in RNA purification kit performance in terms of sensitivity, reproducibility, and observed transcriptome complexity, and demonstrate interactions between specific blood collection tubes, purification kits and time intervals. Our results are summarized in 11 performance metrics that enable an informed selection of the most optimal sample processing workflow for a given experiment. In conclusion, we put forward robust quality control metrics for exRNA quantification methods with validated standard operating procedures (SOPs), representing paramount groundwork for future exRNA-based precision medicine applications.

Abstract Robust benchmarking studies have highlighted how measured relative microbial abundances can vary dramatically depending on how DNA is extracted, made into libraries, sequenced, and analyzed. To build upon prior research, we investigated how sample preservation and storage choices impact observed absolute microbial load and relative metagenomic and metatranscriptomic measurements. Specifically, we studied how two common stool preservatives (OMNIgene GUT OMR200 and Zymo DNA/RNA PowerShield) perform across a range of storage temperatures (−80°C, 23°C and 40°C). For immediately frozen samples with no preservatives, we observed a mean colonic load of ∼100 trillion (1.2 × 10 14 ) prokaryotes across ten donors, revising the gut prokaryote:human cell ratio of ∼1:1 to ∼4:1. We found that both preservatives introduce significant bias in the metagenomics results; and, while OMNIgene results were robust to storage temperature, samples stored in Zymo preservative had further bias with increasing storage temperatures. In terms of measured composition, we observed a ∼1.9x and ∼1.5x difference in the metagenomic Bacteroidetes:Firmicutes ratio in OMNIgene and Zymo preservatives, respectively. Absolute abundance measurements revealed that these differences are driven by higher measured Bacteroidetes in OMNIgene-preserved samples and lower measured Firmicutes in Zymo-preserved samples. For metatranscriptomic measurements, we also found that both preservatives introduced bias, but that RNA likely degraded in samples stored in OMNIgene preservative at high temperature. In summary, we recommend the OMNIgene preservative for studies that include significant field components. For metatranscriptomics studies, we recommend kits rated for RNA preservation such as the Zymo kit; however, existing samples collected in non-RNA rated kits might also be viable for limited metatranscriptomic studies. This study demonstrates how sample collection and storage choices can affect measured microbiome research outcomes, makes additional concrete suggestions for sample handling best practices, and demonstrates the importance of including absolute abundance measurements in microbiome studies.

The mammalian response to endoplasmic reticulum (ER) stress dynamically affects all layers of gene expression regulation. We quantified transcript and protein abundance along with footprints of ribosomes and non-ribosomal proteins for thousands of genes in cervical cancer cells responding to treatment with tunicamycin or hydrogen peroxide over an eight hour time course. We identify shared and stress-specific significant regulatory events at the transcriptional and post-transcriptional level and at different phases of the experiment. ER stress regulators increase transcription and translation at different times supporting an adaptive response. ER stress also induces translation of genes from serine biosynthesis and one-carbon metabolism indicating a shift in energy production. Discordant regulation of DNA repair genes suggests transcriptional priming in which delayed translation fine-tunes the early change in the transcriptome. Finally, case studies on stress-dependent alternative splicing and protein-mRNA binding demonstrate the ability of this resource to generate hypotheses for new regulatory mechanisms.

ABSTRACT Intron branch point (BP) recognition by the U2 snRNP is a critical step of splicing, vulnerable to recurrent cancer mutations and bacterial natural product inhibitors. The BP binds a conserved pocket in the SF3B1 (human) or Hsh155 (yeast) U2 snRNP protein. Amino acids that line this pocket affect binding of splicing inhibitors like Pladienolide-B (Plad-B), such that organisms differ in their sensitivity. To study the mechanism of splicing inhibitor action in a simplified system, we modified the naturally Plad-B resistant yeast Saccharomyces cerevisiae by changing 14 amino acids in the Hsh155 BP pocket to those from human. This humanized yeast grows normally, and splicing is largely unaffected by the mutation. Minutes after addition of Plad-B splicing is inhibited, however different introns appear inhibited to different extents. Intron-specific inhibition differences are also observed when we measure co-transcriptional splicing in Plad-B using single-molecule intron tracking (SMIT) to minimize gene-specific transcription and decay rates that cloud estimates of inhibition by standard RNA-seq. Comparison of Plad-B intron sensitivities to those of the structurally distinct inhibitor Thailanstatin-A reveals intron-specific differences in sensitivity to different compounds. This work exposes a complex relationship between binding of different members of this class of inhibitors to the spliceosome and intron-specific rates of BP recognition and catalysis. The results echo and extend observations from mammalian cells, where inhibitor studies are complicated by multi-intron gene architecture and alternative splicing. The more compact yeast system may hasten characterization of splicing inhibitors, accelerating improvements in selectivity and therapeutic efficacy.

Abstract Extracellular RNAs present in biofluids have emerged as potential biomarkers for disease. Where most studies focus on plasma or serum, other biofluids may contain more informative RNA molecules, depending on the type of disease. Here, we present an unprecedented atlas of messenger, circular and small RNA transcriptomes of a comprehensive collection of 20 different human biofluids. By means of synthetic spike-in controls, we compared RNA content across biofluids, revealing a more than 10 000-fold difference in RNA concentration. The circular RNA fraction is increased in nearly all biofluids compared to tissues. Each biofluid transcriptome is enriched for RNA molecules derived from specific tissues and cell types. In addition, a subset of biofluids, including stool, sweat, saliva and sputum, contains high levels of bacterial RNAs. Our atlas enables a more informed selection of the most relevant biofluid to monitor particular diseases. To verify the biomarker potential in these biofluids, four validation cohorts representing a broad spectrum of diseases were profiled, revealing numerous differential RNAs between case and control subjects. Taken together, our results reveal novel insights in the RNA content of human biofluids and may serve as a valuable resource for future biomarker studies. All spike-normalized data is publicly available in the R2 web portal and serve as a basis to further explore the RNA content in biofluids.

The human transcriptome consists of various RNA biotypes including multiple types of non-coding RNAs (ncRNAs). Current ncRNA compendia remain incomplete partially because they are almost exclusively derived from the interrogation of small- and polyadenylated RNAs. Here, we present a more comprehensive atlas of the human transcriptome that is derived from matching polyA-, total-, and small-RNA profiles of a heterogeneous collection of nearly 300 human tissues and cell lines. We report on thousands of novel RNA species across all major RNA biotypes, including a hitherto poorly-cataloged class of non-polyadenylated single-exon long non-coding RNAs. In addition, we exploit intron abundance estimates from total RNA-sequencing to test and verify functional regulation by novel non-coding RNAs. Our study represents a substantial expansion of the current catalogue of human ncRNAs and their regulatory interactions. All data, analyses, and results are available in the R2 web portal and serve as a basis to further explore RNA biology and function.