We use alternating-laser excitation to achieve fluorescence-aided molecule sorting (FAMS) and enable simultaneous analysis of biomolecular structure and interactions at the level of single molecules. This was performed by labeling biomolecules with fluorophores that serve as donor–acceptor pairs for Förster resonance energy transfer, and by using alternating-laser excitation to excite directly both donors and acceptors present in single diffusing molecules. Emissions were reduced to the distance-dependent ratio E , and a distance-independent, stoichiometry-based ratio S . Histograms of E and S sorted species based on the conformation and association status of each species. S was sensitive to the stoichiometry and relative brightness of fluorophores in single molecules, observables that can monitor oligomerization and local-environment changes, respectively. FAMS permits equilibrium and kinetic analysis of macromolecule-ligand interactions; this was validated by measuring equilibrium and kinetic dissociation constants for the interaction of Escherichia coli catabolite activator protein with DNA. FAMS is a general platform for ratiometric measurements that report on structure, dynamics, stoichiometries, environment, and interactions of diffusing or immobilized molecules, thus enabling detailed mechanistic studies and ultrasensitive diagnostics.

ABSTRACT Brain function relies on neurotransmission which is stabilized by presynaptic homeostatic potentiation (PHP). PHP operates on time scales ranging from minute- to life-long adaptations and likely involves reorganization of presynaptic active zones (AZs). At Drosophila melanogaster neuromuscular junctions, earlier work ascribed AZ enlargement by incorporating more Bruchpilot (Brp) scaffold protein a central mechanistic role in PHP. We used localization microscopy ( direct stochastic optical reconstruction microscopy, d STORM) and hierarchical density-based spatial clustering of applications with noise (HDBSCAN) to study AZ plasticity during PHP. We found that both acute, philanthotoxin (PhTx)-induced and chronic, genetically-induced PHP lead to compaction of individual AZs without altering Brp copy numbers per AZ. This compaction even occurs within Brp subclusters of the AZ scaffold which also move towards AZ centers. Furthermore, lowering imaging resolution revealed how AZ compaction in PHP translates into apparent increases in AZ area and Brp protein content as implied earlier. Our results suggest AZ compaction in PHP as an effective mechanism to raise presynaptic protein density and transmitter release. SIGNIFICANCE STATEMENT Homeostatic plasticity stabilizes chemical synaptic transmission in multiple organisms ranging from insects to humans. Changes in active zones (AZs), membrane specializations of the presynapse where synaptic vesicles are discharged, are thought to be crucial in homeostatic adaptations. AZ growth by protein incorporation was proposed as a core mechanism in presynaptic homeostatic potentiation (PHP). Localization microscopy of an abundant AZ scaffold protein uncovered that instead of growing, AZs are compacted in acute and chronic PHP. At lower imaging resolution, however, AZs appear larger and brighter although protein numbers are not increased. In summary, our findings suggest AZ compaction as new and effective mechanism to raise presynaptic protein density and transmitter release in PHP.

Abstract In neurons, endoplasmic reticulum forms a highly dynamic network that enters axons and presynaptic terminals and plays a central role in Ca 2+ homeostasis and synapse maintenance. However, the underlying mechanisms involved in regulation of its dynamic remodeling as well as its function in axon development and presynaptic differentiation remain elusive. Here, we used high resolution microscopy and live cell imaging to investigate rapid movements of endoplasmic reticulum and ribosomes in axons of cultured motoneurons after stimulation with Brain-derived neurotrophic factor. Our results indicate that the endoplasmic reticulum extends into axonal growth cone filopodia where its integrity and dynamic remodeling are regulated mainly by actin and its motor protein myosin VI. Additionally, we found that in axonal growth cones, ribosomes assemble into 80S subunits within seconds and associate with ER in response to extracellular stimuli which describes a novel function of axonal ER in dynamic regulation of local translation. Summary statement In axonal growth cones of motoneurons, dynamic remodeling of ER is coordinated through drebrin A-mediated actin and microtubule crosstalk and contributes to local translation as response to BDNF stimulation.

Abstract The angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) has been identified as entry receptor on cells enabling binding and infection with the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) via trimeric spike (S) proteins protruding from the viral surface 1,2 . It has been suggested that trimeric S proteins preferably bind to plasma membrane areas with high concentrations of preferably multimeric ACE2 receptors to achieve a higher binding and infection efficiency 1,3 . However, our current knowledge about the influence of ACE2 expression and organization in the plasma membrane on SARS-CoV-2 infection efficiency remains elusive. Here we used direct stochastic optical reconstruction microscopy ( d STORM) in combination with different labeling approaches to visualize the distribution and quantify the expression of ACE2 on different cells. Our results reveal that endogenous ACE2 receptors are present as monomers in the plasma membrane with densities of only 1-2 receptors μm -2 . In addition, binding of trimeric S proteins does not induce clustering of ACE2 receptors in the plasma membrane. Supported by infection studies using vesicular stomatitis virus (VSV) particles bearing S proteins our data demonstrate that a single S protein interaction per virus particle with a monomeric ACE2 receptor is sufficient for infection which attests SARS-CoV-2 a high infectivity.

Abstract Advances in superresolution microscopy demonstrated single-molecule localization precisions of a few nanometers. However, translation of such high localization precisions into sub-10 nm spatial resolution in biological samples remains challenging. Here, we show that resonance energy transfer between fluorophores separated by less than 10 nm results in accelerated fluorescence blinking and consequently lower localization probabilities impeding sub-10 nm fluorescence imaging. We demonstrate that time-resolved fluorescence detection in combination with photoswitching fingerprint analysis can be used advantageously to determine the number and distance even of spatially unresolvable fluorophores in the sub-10 nm range. In combination with genetic code expansion (GCE) with unnatural amino acids and bioorthogonal click-labeling with small fluorophores photoswitching fingerprint analysis enables sub-10 nm resolution fluorescence imaging in cells.

The postsynaptic density (PSD) comprises numerous scaffolding proteins, receptors, and signaling molecules that coordinate synaptic transmission in the brain. Postsynaptic density protein 95 (PSD-95) is a master scaffold protein within the PSD and one of its most abundant proteins and therefore constitutes a very attractive biomarker of PSD function and its pathological changes. Here, we exploit a high-affinity inhibitor of PSD-95, AVLX-144, as a template for developing probes for molecular imaging of the PSD. AVLX-144-based probes were labeled with the radioisotopes fluorine-18 and tritium, as well as a fluorescent tag. Tracer binding showed saturable, displaceable, and uneven distribution in rat brain slices, proving effective in quantitative autoradiography and cell imaging studies. Notably, we observed diminished tracer binding in human post-mortem Parkinson's disease (PD) brain slices, suggesting postsynaptic impairment in PD. We thus offer a suite of translational probes for visualizing and understanding PSD-related pathologies.

Abstract In DNA-PAINT, background fluorescence emerging from unbound imager probes requires the use of low imager concentrations, reducing the imaging speed substantially. Here, we present a novel class of dual-labeled probes that show strong fluorescence quenching when unbound, enabling imaging at higher probe concentrations with an up to ∼15-fold increase in imaging speed and improved resolution. We demonstrate two-dye imager DNA-PAINT (TDI-DNA-PAINT) imaging in cells and on DNA origami. Finally, we demonstrate lattice light-sheet (LLS)-TDI-DNA-PAINT for fast whole-cell three-dimensional (3D) imaging with superior spatial resolution.

Genetic code expansion (GCE) technology allows the specific incorporation of functionalized noncanonical amino acids (ncAAs) into proteins. Here, we investigated the Diels-Alder reaction between trans-cyclooct-2-ene (TCO)-modified ncAAs, and 22 known and novel 1,2,4,5-tetrazine-dye conjugates spanning the entire visible wavelength range. A hallmark of this reaction is its fluorogenicity - the tetrazine moiety can elicit substantial quenching of the dye. We discovered that photoinduced electron transfer (PET) from the excited dye to tetrazine as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. Upon reaction with dienophiles quenching interactions are reduced resulting in a considerable increase in fluorescence intensity. Efficient and specific labeling of all tetrazine-dyes investigated permits super-resolution microscopy with high signal-to-noise ratio even at the single-molecule level. The different cell permeability of tetrazine-dyes can be used advantageously for specific intra- and extracellular labeling of proteins and highly sensitive fluorescence imaging experiments in fixed and living cells.