Over the past decade peptide sequencing by collision induced dissociation (CID) has become the method of choice in mass spectrometry-based proteomics. The development of alternative fragmentation techniques such as electron transfer dissociation (ETD) has extended the possibilities within tandem mass spectrometry. Recent advances in instrumentation allow peptide fragment ions to be detected with high speed and sensitivity (e.g., in a 2D or 3D ion trap) or at high resolution and high mass accuracy (e.g., an Orbitrap or a ToF). Here, we describe a comprehensive experimental comparison of using ETD, ion-trap CID, and beam type CID (HCD) in combination with either linear ion trap or Orbitrap readout for the large-scale analysis of tryptic peptides. We investigate which combination of fragmentation technique and mass analyzer provides the best performance for the analysis of distinct peptide populations such as N-acetylated, phosphorylated, and tryptic peptides with up to two missed cleavages. We found that HCD provides more peptide identifications than CID and ETD for doubly charged peptides. In terms of Mascot score, ETD FT outperforms the other techniques for peptides with charge states higher than 2. Our data shows that there is a trade-off between spectral quality and speed when using the Orbitrap for fragment ion detection. We conclude that a decision-tree regulated combination of higher-energy collisional dissociation (HCD) and ETD can improve the average Mascot score.

Microtubules are cytoskeletal polymers with two structurally and functionally distinct ends, the plus- and the minus-end. Here, we focus on the mechanisms underlying the regulation of microtubule minus-ends by the CAMSAP/Nezha/Patronin protein family. We show that CAMSAP2 is required for the proper organization and stabilization of interphase microtubules and directional cell migration. By combining live-cell imaging and in vitro reconstitution of microtubule assembly from purified components with laser microsurgery, we demonstrate that CAMSAPs regulate microtubule minus-end growth and are specifically deposited on the lattice formed by microtubule minus-end polymerization. This process leads to the formation of CAMSAP-decorated microtubule stretches, which are stabilized from both ends and serve as sites of noncentrosomal microtubule outgrowth. The length of the stretches is regulated by the microtubule-severing protein katanin, which interacts with CAMSAPs. Our data thus indicate that microtubule minus-end assembly drives the stabilization of noncentrosomal microtubules and that katanin regulates this process.

Summary G-quadruplex (or G4) structures are non-canonical DNA structures that form in guanine-rich sequences and threaten genome stability when not properly resolved. G4 unwinding occurs during S phase via an unknown mechanism. Using Xenopus egg extracts, we define a three-step G4 unwinding mechanism that is coupled to DNA replication. First, the replicative helicase (CMG) stalls at a leading strand G4 structure. Second, the DHX36 helicase mediates the bypass of the CMG past the intact G4 structure, which allows approach of the leading strand to the G4. Third, G4 structure unwinding by the FANCJ helicase enables the DNA polymerase to synthesize past the G4 motif. A G4 on the lagging strand template does not stall CMG, but still requires DNA replication for unwinding. DHX36 and FANCJ have partially redundant roles, conferring robustness to this pathway. Our data reveal a novel genome maintenance pathway that promotes faithful G4 replication thereby avoiding genome instability.

Abstract Despite the success of immune checkpoint blockade (ICB) most patients fail to respond durably, in part owing to reduced interferon gamma (IFNγ) sensitivity. Thus, elevating tumor IFNγ-receptor 1 (IFNγ-R1) expression to enhance IFNγ-mediated cytotoxicity is of potential clinical interest. Here, we show that increased IFNγ-R1 expression sensitizes tumors to IFNγ-mediated killing. To unveil the largely undefined mechanism governing IFNγ-R1 expression, we performed a genome-wide CRISPR/Cas9 screen for suppressors of its cell surface abundance. We uncovered STUB1 as key mediator of proteasomal degradation of the IFNγ-R1/JAK1 complex. STUB1 inactivation amplified IFNγ signaling, thereby sensitizing to cytotoxic T cells, but also inducing PD-L1. STUB1 loss in a rational combination with PD-1 blockade strongly inhibited melanomas in vivo . Clinically corroborating these results, a STUB1 -KO gene signature was strongly associated with anti-PD-1 response. These results uncover STUB1 as pivotal regulator of IFNγ tumor signaling and provide a rationale for its inhibition combined with anti-PD-1.

SUMMARY Local mRNA translation in axons is critical for the spatial and temporal regulation of the axonal proteome. A wide variety of mRNAs are localized and translated in axons, however how protein synthesis is regulated at specific subcellular sites in axons remains unclear. Here, we establish that the axonal endoplasmic reticulum (ER) supports axonal translation. Axonal ER tubule disruption impairs local translation and ribosome distribution. Using nanoscale resolution imaging, we find that ribosomes make frequent contacts with ER tubules in the axon in a translation-dependent manner and are influenced by specific extrinsic cues. We identify P180/RRBP1 as an axonally distributed ribosome receptor that regulates local translation in an mRNA-dependent manner. Our results establish an important role for the axonal ER in localizing mRNA translation and in dynamically regulating the axonal proteome in response to neuronal stimuli.

Summary Switch-like cyclin-dependent kinase (CDK)-1 activation is thought to underlie the abruptness of mitotic onset, but how CDKs can simultaneously phosphorylate many diverse substrates is unknown, and direct evidence for such phosphorylation dynamics in vivo is lacking. Here, we analysed protein phosphorylation states in single Xenopus embryos throughout synchronous cell cycles. Over a thousand phosphosites were dynamic in vivo , and assignment of cell cycle phases using egg extracts revealed hundreds of S-phase phosphorylations. Targeted phosphoproteomics in single embryos showed switch-like mitotic phosphorylation of diverse protein complexes. The majority of cell cycle-regulated phosphosites occurred in CDK consensus motifs, and 72% located to intrinsically disordered regions. Dynamically phosphorylated proteins, and documented substrates of cell cycle kinases, are significantly more disordered than phosphoproteins in general. Furthermore, 30-50% are components of membraneless organelles. Our results suggest that phosphorylation of intrinsically disordered proteins by cell cycle kinases, particularly CDKs, allows switch-like mitotic cellular reorganisation.

Abstract γ-tubulin ring complex (γ-TuRC) is the major microtubule-nucleating factor. After nucleation, microtubules can be released from γ-TuRC and stabilized by other proteins, such as CAMSAPs, but the biochemical cross-talk between minus-end regulation pathways is poorly understood. Here, we reconstituted this process in vitro using purified components. We found that all CAMSAP proteins could bind to the minus-ends of γ-TuRC-attached microtubules. CAMSAP2 and CAMSAP3, which decorate and stabilize growing minus ends, but not the minus-end tracking protein CAMSAP1 induced microtubule release from γ-TuRC. CDK5RAP2, a γ-TuRC-interactor, and CLASP2, a regulator of microtubule growth, stimulated γ-TuRC-dependent microtubule nucleation, but only CDK5RAP2 inhibited CAMSAP-driven microtubule detachment by suppressing CAMSAP binding to γ-TuRC-anchored minus ends. CDK5RAP2 also improved γ-TuRC selectivity for 13-rather than 14-protofilament microtubules in microtubule-capping assays. Our results support a model whereby CAMSAPs exploit an imperfect attachment between γ-TuRC and the nucleated microtubule to promote minus-end elongation and release, whereas CDK5RAP2 improves the fit between γ-TuRC and 13-protofilament microtubules and enhances nucleation.

Summary Fibroblast growth factors (FGFs) are paracrine or endocrine signaling proteins that, activated by their ligands, elicit a wide range of health and disease-related processes, such as cell proliferation and the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). The detailed molecular pathway dynamics that coordinate these responses have remained to be determined. To elucidate these, we stimulated MCF-7 breast cancer cells with either FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, or FGF19. Following activation of the receptor, we quantified the kinase activity dynamics of 44 kinases using a targeted mass spectrometry assay. Our system-wide kinase activity data, supplemented with (phospho)proteomics data, reveal ligand-dependent distinct pathway dynamics, elucidate the involvement of not earlier reported kinases such as MARK, and revise some of the pathway effects on biological outcomes. In addition, logic-based dynamic modeling of the kinome dynamics further verifies the biological goodness-of-fit of the predicted models and reveals tight regulation of the RAF kinase family.

Abstract In this study, we measured the kinase activity profiles of 32 pre-treatment tumour biopsies of HER2-positive breast cancer patients. The aim of this study was to assess the prognostic potential of kinase activity levels to identify potential mechanisms of resistance and to predict treatment success of HER2-targeted therapy combined with chemotherapy. Indeed, our system-wide kinase activity analysis, based on targeted mass spectrometry measurement of kinase activation loops, allowed us to link kinase activity to treatment response. Overall, high kinase activity in the HER2-pathway was associated with good treatment outcome. Furthermore, we found eleven kinases differentially regulated between treatment outcome groups. Amongst those, well-known players in therapy resistance were found, such as p38a, ERK and FAK, as well as a potential new player in drug resistance, namely MARK. Lastly, we defined an optimal signature of four kinases in a multiple logistic regression diagnostic test for prediction of treatment outcome (AUC=0.926). This kinase signature showed high sensitivity and specificity, indicating its potential as predictive biomarker for treatment success of HER2-targeted therapy.

ABSTRACT How steroid hormone receptors (SHRs) orchestrate transcriptional activity remains only partly understood. Upon activation, SHRs bind the genome and recruit their co-regulators, crucial to induce gene expression. However, it remains unknown which components of the SHR-recruited co-regulator complex are essential to drive transcription following hormonal stimuli. Through a FACS-based genome-wide CRISPR screen, we comprehensively dissected the Glucocorticoid Receptor (GR) co-regulatory complex involved in gene-target regulation. We describe a novel functional cross-talk between PAXIP1 and the cohesin subunit STAG2 that is critical for regulation of gene expression by GR. Without altering the GR cistrome, PAXIP1 and STAG2 depletion alter the GR transcriptome, by impairing the recruitment of 3D-genome organization proteins to the GR complex. Importantly, we demonstrate that PAXIP1 is required for stability of cohesin on the genome, its localization to GR-occupied sites, and maintenance of enhancer-promoter interactions. Moreover, in lung cancer, where GR acts as tumor suppressor, PAXIP1/STAG2 loss enhances GR-mediated tumor suppressor activity by modifying local chromatin interactions. All together, we introduce PAXIP1 and STAG2 as novel co-regulators of GR, required to maintain 3D-genome architecture and drive the GR transcriptional programme following hormonal stimuli.