Abstract Ultraviolet radiation (UVR) and its deleterious effects on living cells selects for UVR-protective mechanisms. Organisms across the tree of life evolved a variety of natural sunscreens to prevent UVR-induced cellular damage and stress. However, in vertebrates, only melanin is known to act as a sunscreen. Here we demonstrate that gadusol, a transparent compound discovered over 40 years ago in fish eggs, is a maternally provided sunscreen required for survival of embryonic and larval zebrafish exposed to UVR. Mutating an enzyme involved in gadusol biosynthesis increases the formation of cyclobutane pyrimidine dimers, a hallmark of UVB-induced DNA damage. Compared to the contributions of melanin and the chorion, gadusol is the primary sunscreening mechanism in embryonic and larval fish. The gadusol biosynthetic pathway is retained in the vast majority of teleost genomes but is repeatedly lost in species whose young are no longer exposed to UVR. Our data demonstrate that gadusol is a maternally provided sunscreen that is critical for early-life survival in the most species-rich branch of the vertebrate phylogeny.

Zebrafish are popular research organisms selected for laboratory use due in part to widespread availability from the pet trade. Many contemporary colonies of laboratory zebrafish are maintained in aquaculture facilities that monitor and aim to curb infections that can negatively affect colony health and confound experiments. The impact of laboratory control on the microbial constituents associated with zebrafish in research environments compared to the pet trade are unclear. Diseases of unknown causes are common in both environments. We conducted a metatranscriptomic survey to broadly compare the zebrafish-associated microbes in pet trade and laboratory environments. We detected many microbes in animals from the pet trade that were not found in laboratory animals. Cohousing experiments revealed several transmissible microbes including a newly described non-enveloped, double-stranded RNA virus in the Birnaviridae family we name Rocky Mountain birnavirus (RMBV). Infections were detected in asymptomatic animals from the pet trade, but when transmitted to laboratory animals RMBV was associated with pronounced antiviral responses and hemorrhagic disease. These experiments highlight the pet trade as a distinct source of diverse microbes that associate with zebrafish and establish a paradigm for the discovery of newly described pathogenic viruses and other infectious microbes that can be developed for study in the laboratory.

Hundreds of cell types are generated during development, but their lineage relationships are largely elusive. Here we report a technology, scGESTALT, which combines cell type identification by single-cell RNA sequencing with lineage recording by cumulative barcode editing. We sequenced ~60,000 transcriptomes from the juvenile zebrafish brain and identified more than 100 cell types and marker genes. We engineered an inducible system that combines early and late barcode editing and isolated thousands of single-cell transcriptomes and their associated barcodes. The large diversity of edited barcodes and cell types enabled the generation of lineage trees with hundreds of branches. Inspection of lineage trajectories identified restrictions at the level of cell types and brain regions and helped uncover gene expression cascades during differentiation. These results establish scGESTALT as a new and widely applicable tool to simultaneously characterize the molecular identities and lineage histories of thousands of cells during development and disease.

We present ampliCan, an analysis tool that unites identification, quantification and visualization of genuine genome editing events from CRISPR amplicon sequencing data. ampliCan overcomes methodological challenges suffered by other tools to estimate the true mutational efficiency in a high-throughput automated fashion. ampliCan controls for biases at every step of the analysis and generates reports that allow users to quickly identify successful editing events or potential issues with their experiments. We benchmarked ampliCan against other leading tools demonstrating that it outperformed all in the face of common confounding factors.

Adult humans respond to heart injury by forming a permanent scar, yet other vertebrates are capable of robust and complete cardiac regeneration. Despite progress towards characterizing the mechanisms of cardiac regeneration in fish and amphibians, the large evolutionary gulf between mammals and regenerating vertebrates complicates deciphering which cellular and molecular features truly enable regeneration. To better define these features, we compared cardiac injury responses in zebrafish and medaka, two fish species that share similar heart anatomy and common teleost ancestry but differ in regenerative capability. We used single-cell transcriptional profiling to create a time-resolved comparative cell atlas of injury responses in all major cardiac cell types across both species. With this approach, we identified several key features that distinguish cardiac injury response in the non-regenerating medaka heart. By comparing immune responses to injury, we found altered cell recruitment and a distinct pro-inflammatory gene program in medaka leukocytes, and an absence of the injury-induced interferon response seen in zebrafish. In addition, we found a lack of pro-regenerative signals, including nrg1 and retinoic acid, from medaka endothelial and epicardial cells. Finally, we identified alterations in the myocardial structure in medaka, where they lack embryonic-like primordial layer cardiomyocytes, and fail to employ a cardioprotective gene program shared by regenerating vertebrates. Our findings reveal notable variation in injury response across nearly all major cardiac cell types in zebrafish and medaka, demonstrating how evolutionary divergence influences the hidden cellular features underpinning regenerative potential in these seemingly similar vertebrates.

ABSTRACT Zebrafish are popular research organisms selected for laboratory use due in part to widespread availability from the pet trade. Many contemporary colonies of laboratory zebrafish are maintained in aquaculture facilities that monitor and aim to curb infections that can negatively affect colony health and confound experiments. The impact of laboratory control on the microbial constituents associated with zebrafish in research environments compared to the pet trade are unclear. Diseases of unknown causes are common in both environments. We conducted a metagenomic survey to broadly compare the zebrafish-associated microbes in pet trade and laboratory environments. We detected many microbes in animals from the pet trade that were not found in laboratory animals. Co-housing experiments revealed several transmissible microbes including a newly described non-enveloped, double-stranded RNA virus in the Birnaviridae family we name Rocky Mountain birnavirus (RMBV). Infections were detected in asymptomatic animals from the pet trade, but when transmitted to laboratory animals RMBV was associated with pronounced antiviral responses and hemorrhagic disease. These experiments highlight the pet trade as a distinct source of diverse microbes that associate with zebrafish and establish a paradigm for the discovery of newly described pathogenic viruses and other infectious microbes that can be developed for study in the laboratory.

Abstract Vertebrate spermatogonial stem cells maintain sperm production over the lifetime of an animal but fertility declines with age. While morphological studies have greatly informed our understanding of typical spermatogenesis, the molecular and cellular mechanisms underlying spermatogenesis are not yet understood, particularly with respect to the onset of fertility. We used single-cell RNA sequencing to generate a developmental atlas of the zebrafish testis. Using 5 timepoints across the adult life of a zebrafish, we described cellular profiles in the testis during and after fertility. While all germ cell stages of spermatogenesis are detected in testes from fertile adult zebrafish, testes from older infertile males only contained spermatogonia and a reduced population of spermatocytes. These remaining germ cells are transcriptionally distinct from fertile spermatogonia. Immune cells including macrophages and lymphocytes drastically increase in abundance in infertile testes. Our developmental atlas reveals the cellular changes as the testis ages and defines a molecular roadmap for the regulation of male fertility.

Down Syndrome Cell Adhesion Molecules (dscam and dscaml1) are essential regulators of neural circuit assembly, but their roles in vertebrate neural circuit function are still mostly unexplored. We investigated the role of dscaml1 in the zebrafish oculomotor system, where behavior, circuit function, and neuronal activity can be precisely quantified. Loss of zebrafish dscaml1 resulted in deficits in retinal patterning and light adaptation, consistent with its known roles in mammals. Oculomotor analyses showed that mutants have abnormal gaze stabilization, impaired fixation, disconjugation, and faster fatigue. Notably, the saccade and fatigue phenotypes in dscaml1 mutants are reminiscent of human ocular motor apraxia, for which no animal model exists. Two-photon calcium imaging showed that loss of dscaml1 leads to impairment in the saccadic premotor pathway but not the pretectum-vestibular premotor pathway, indicating a subcircuit requirement for dscaml1. Together, we show that dscaml1 has both broad and specific roles in oculomotor circuit function, providing a new animal model to investigate the development of premotor pathways and their associated human ocular disorders.

Abstract The CRISPR-Cas universe continues to expand. The type II CRISPR-Cas system from Streptococcus pyogenes (SpyCas9) is the most widely used for genome editing due to its high efficiency in cells and organisms. However, concentrating on a single CRISPR-Cas system imposes limits on target selection and multiplexed genome engineering. We hypothesized that CRISPR-Cas systems originating from different bacterial species could operate simultaneously and independently due to their distinct single-guide RNAs (sgRNAs) or CRISPR-RNAs (crRNAs), and protospacer adjacent motifs (PAMs). Additionally, we hypothesized that CRISPR-Cas activity in zebrafish could be regulated through the expression of inhibitory anti-CRISPR (Acr) proteins. Here, we use a simple mutagenesis approach to demonstrate that CRISPR-Cas systems from Streptococcus pyogenes (SpyCas9), Streptococcus aureus (SauCas9), Lachnospiraceae bacterium (LbaCas12a, previously known as LbCpf1), are orthogonal systems capable of operating simultaneously in zebrafish. CRISPR systems from Acidaminococcus sp. (AspCas12a, previously known as AsCpf1) and Neisseria meningitidis (Nme2Cas9) were also active in embryos. We implemented multichannel CRISPR recording using three CRISPR systems and show that LbaCas12a may provide superior information density compared to previous methods. We also demonstrate that type II Acrs (anti-CRISPRs) are effective inhibitors of SpyCas9 in zebrafish. Our results indicate that at least five CRISPR-Cas systems and two anti-CRISPR proteins are functional in zebrafish embryos. These orthogonal CRISPR-Cas systems and Acr proteins will enable combinatorial and intersectional strategies for spatiotemporal control of genome editing and genetic recording in animals.

The role of the zebrafish transcription factor Nanog has been controversial. It has been suggested that Nanog is primarily required for the formation of the extraembryonic yolk syncytial layer (YSL) and only indirectly regulates gene expression in embryonic cells. By contrast, a more recent study has proposed that Nanog directly regulates transcription in embryonic cells during zygotic genome activation. To clarify the roles of Nanog, we performed a detailed analysis of zebrafish nanog mutants. While zygotic nanog mutants survive to adulthood, maternal-zygotic and maternal mutants exhibit developmental arrest at the blastula stage. In the absence of Nanog, the YSL fails to form and embryonic tissue detaches from the yolk. Zygotic transcription of a subset of embryonic genes is affected in nanog mutants but both the YSL and embryonic phenotype can be rescued by providing nanog mRNA in YSL precursors. Notably, nanog mutant cells transplanted into wild-type hosts proliferate and contribute to embryonic tissues from all germ layers. These results indicate that zebrafish Nanog is necessary for YSL formation but is not directly required for embryonic cell differentiation.