Abstract Different intensities of high temperatures affect the growth of photosynthetic cells in nature. To elucidate the underlying mechanisms, we cultivated the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii under highly controlled photobioreactor conditions and revealed systems-wide shared and unique responses to 24-hour moderate (35°C) and acute (40°C) high temperatures and subsequent recovery at 25°C. We identified previously overlooked unique elements in response to moderate high temperature. Heat at 35°C transiently arrested the cell cycle followed by partial synchronization, up-regulated transcripts/proteins involved in gluconeogenesis/glyoxylate-cycle for carbon uptake, promoted growth, and increased starch accumulation. Heat at 40°C arrested the cell cycle, inhibited growth, resulting in carbon uptake over usage and increased starch accumulation. Both high temperatures induced photoprotection, while 40°C decreased photosynthetic efficiency, distorted thylakoid/pyrenoid ultrastructure, and affected the carbon concentrating mechanism. We demonstrated increased transcript/protein correlation during both heat treatments, suggesting reduced post-transcriptional regulation during heat may help coordinate heat tolerance activities efficiently. During recovery after both heat treatments, transcripts/proteins related to DNA synthesis increased while those involved in photosynthetic light reactions decreased. We propose down-regulating photosynthetic light reactions during DNA replication benefits cell cycle resumption by reducing ROS production. Our results provide potential targets to increase thermotolerance in algae and crops.

Abstract Despite sexual development being ubiquitous to vertebrates, the epigenetic mechanisms controlling this fundamental transition remain largely undocumented in many organisms. Through whole-methylome, whole-transcriptome and chromatin landscape sequencing, we discovered global control mechanisms as well as specific regulators of sexual maturation in Atlantic salmon. This large integrated study was based on an experimental time course that successfully sampled the period when Atlantic salmon commence their trajectory towards sexual maturation. Co-analysis of DNA methylome and gene expression changes revealed chromatin remodelling genes arid1b and smarca2 were both significantly hypermethylated and upregulated in the ovary during the onset of maturation. We also observed changes in chromatin state landscape occurred early in the transition and were strongly correlated with fundamental remodelling of gene expression. Finally, we integrated our multiomics datasets to identify trim25 and znf423 as key regulators in the pituitary that underwent 60 fold change in connectivity during the transition to sexual maturation. The study provides a comprehensive view of the spatiotemporal changes involved in a complex trait and opens the door to future efforts aiming to manipulate puberty in an economically important aquaculture species.

Acyl carrier proteins (ACPs) are the scaffolds for fatty acid biosynthesis in living systems, rendering them essential to a comprehensive understanding of lipid metabolism; however, accurate quantitative methods to assess individual acyl-ACPs do not exist. A robust method was developed to quantify acyl-ACPs at picogram levels. Acyl-ACP elongation intermediates (3-hydroxyacyl-ACPs and 2, 3-trans-enoyl-ACPs), and unexpected medium chain (C10:1, C14:1) and polyunsaturated long chain acyl-ACPs (C16:3) were also identified, indicating the sensitivity of the method and that descriptions of lipid metabolism and ACP function are incomplete. Such ACPs are likely important to medium chain lipid production for fuels and highlight poorly understood lipid remodeling events in the chloroplast. The approach is broadly applicable to Type II FAS systems found in plants, bacteria, and mitochondria of animal and fungal systems because it uses a strategy that capitalizes on a highly conserved Asp-Ser-Leu-Asp (DSLD) amino acid sequence in ACPs to which acyl groups are attached. This allows for sensitive quantification using LC-MS/MS with de novo generated standards and an isotopic dilution strategy and will fill a gap in understanding, providing insights through quantitative exploration of fatty acid biosynthesis processes for optimal biofuels, renewable feed stocks, and medical studies in health and disease.

Abstract The timing of many molecular and physiological processes in plants occurs at a specific time of day. These daily rhythms are driven by the circadian clock, a master timekeeper that uses daylength and temperature to maintain rhythms of approximately 24 hours in various clock-regulated phenotypes. The circadian MYB-like transcription factor REVEILLE 8 (RVE8) interacts with its transcriptional coactivators NIGHT LIGHT INDUCIBLE AND CLOCK REGULATED 1 (LNK1) and LNK2 to promote the expression of evening-phased clock genes and cold tolerance factors. While genetic approaches have commonly been used to discover new connections within the clock and between other pathways, here we use affinity purification coupled with mass spectrometry to discover time-of-day-specific protein interactors of the RVE8-LNK1/2 complex. Among the interactors of RVE8/LNK1/LNK2 were COLD REGULATED GENE 27 (COR27) and COR28, which were coprecipitated in an evening-specific manner. In addition to COR27/28, we found an enrichment of temperature-related interactors that led us to establish a novel role for LNK1/2 in temperature entrainment of the clock. We established that RVE8, LNK1, and either COR27 or COR28 form a tripartite complex in yeast and that the effect of this interaction in planta serves to antagonize transcriptional activation of RVE8 target genes through mediating RVE8 protein degradation in the evening. Together, these results illustrate how a proteomic approach identified time-of-day-specific protein interactions and a novel RVE8-LNK-COR protein complex that implicates a new regulatory mechanism for circadian and temperature signaling pathways.

Protein phosphorylation is one of the most prevalent post-translational modifications found in eukaryotic systems and serves as a key molecular mechanism by which protein function is regulated in response to environmental stimuli. The Mut9-Like Kinases (MLKs) are a plant-specific family of Ser/Thr kinases that have been linked to light, circadian, and abiotic stress signaling. Here we use quantitative phosphoproteomics in conjunction with global proteomic analysis to explore the role of the MLKs in daily protein dynamics. In the absence of MLK family kinases, proteins involved in light, circadian, and hormone signaling as well as several chromatin modifying enzymes were found to have altered phosphorylation profiles. Additionally, mlk mutant seedlings were found to have elevated glucosinolate accumulation and increased sensitivity to DNA damage. Our analysis in combination with previously reported data supports the involvement of MLKs in a diverse set of stress responses and developmental processes, suggesting that the MLKs may serve as key regulators linking environmental inputs to developmental outputs.

Plant responses to the environment are shaped by external stimuli and internal signaling pathways. In both the model plant Arabidopsis thaliana and crop species, circadian clock factors have been identified as critical for growth, flowering and circadian rhythms. Outside of A. thaliana, however, little is known about the molecular function of clock genes. Therefore, we sought to compare the function of Brachypodium distachyon and Seteria viridis orthologs of EARLY FLOWERING3, a key clock gene in A. thaliana. To identify both cycling genes and putative ELF3 functional orthologs in S. viridis, a circadian RNA-seq dataset and online query tool (Diel Explorer) was generated as a community resource to explore expression profiles of Setaria genes under constant conditions after photo- or thermo-entrainment. The function of ELF3 orthologs from A. thaliana, B. distachyon, and S. viridis were tested for complementation of an elf3 mutation in A. thaliana. Despite comparably low sequence identity versus AtELF3 (less than 37%), both monocot orthologs were capable of rescuing hypocotyl elongation, flowering time and arrhythmic clock phenotypes. Molecular analysis using affinity purification and mass spectrometry to compare physical interactions also found that BdELF3 and SvELF3 could be integrated into similar complexes and networks as AtELF3, including forming a composite evening complex. Thus, we find that, despite 180 million years of separation, BdELF3 and SvELF3 can functionally complement loss of ELF3 at the molecular and physiological level.

Abstract Untargeted metabolomics enables direct quantification of metabolites without apriori knowledge of their identity. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), a popular method to implement untargeted metabolomics, identifies metabolites via combined mass/charge (m/z) and retention time as mass features. Improvements in the sensitivity of mass spectrometers has increased the complexity of data produced, leading to computational obstacles. One outstanding challenge is calling metabolite mass feature peaks rapidly and accurately in large LC-MS datasets (dozens to thousands of samples) in the presence of measurement and other noise. While existing algorithms are useful, they have limitations that become pronounced at scale and lead to false positive metabolite predictions as well as signal dropouts. To overcome some of these shortcomings, biochemists have developed hybrid computational and carbon labeling techniques, such as credentialing. Credentialing can validate metabolite signals, but is laborious and its applicability is limited. We have developed a suite of three computational tools to overcome the challenges of unreliable algorithms and inefficient validation protocols: isolock, autoCredential and anovAlign. Isolock uses isopairs, or metabolite-istopologue pairs, to calculate and correct for mass drift noise across LC-MS runs. autoCredential leverages statistical features of LC-MS data to amplify naturally present 13C isotopologues and validate metabolites through isopairs. This obviates the need to artificially introduce carbon labeling. anovAlign, an anova-derived algorithm, is used to align retention time windows across samples to accurately delineate retention time windows for mass features. Using a large published clinical dataset as well as a plant dataset with biological replicates across time, genotype and treatment, we demonstrate that this suite of tools is more sensitive and reproducible than both an open source metabolomics pipelines, XCMS, and the commercial software progenesis QI. This software suite opens a new era for enhanced accuracy and increased throughput for untargeted metabolomics.

Untargeted lipidomics allows analysis of a broader range of lipids than targeted methods and permits discovery of unknown compounds. Previous ring trials have evaluated the reproducibility of targeted lipidomics methods, but inter-laboratory comparison of compound identification and unknown feature detection in untargeted lipidomics has not been attempted. To address this gap, five laboratories analyzed a set of mammalian tissue and biofluid reference samples using both their own untargeted lipidomics procedures and a common chromatographic and data analysis method. While both methods yielded informative data, the common method improved chromatographic reproducibility and resulted in detection of more shared features between labs. Spectral search against the LipidBlast in silico library enabled identification of over 2,000 unique lipids. Further examination of LC-MS/MS and ion mobility data, aided by hybrid search and spectral networking analysis, revealed spectral and chromatographic patterns useful for classification of unknown features, a subset of which were highly reproducible between labs. Overall, our method offers enhanced compound identification performance compared to targeted lipidomics, demonstrates the potential of harmonized methods to improve inter-site reproducibility for quantitation and feature alignment, and can serve as a reference to aid future annotation of untargeted lipidomics data.