Aberrant expression of embryonic epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors (EMT-TFs) in epithelial cells triggers EMT, neoplastic transformation, stemness, and metastatic dissemination. We found that regulation and functions of EMT-TFs are different in malignant melanoma. SNAIL2 and ZEB2 transcription factors are expressed in normal melanocytes and behave as tumor-suppressor proteins by activating an MITF-dependent melanocyte differentiation program. In response to NRAS/BRAF activation, EMT-TF network undergoes a profound reorganization in favor of TWIST1 and ZEB1. This reversible switch cooperates with BRAF in promoting dedifferentiation and neoplastic transformation of melanocytes. We detected EMT-TF reprogramming in late-stage melanoma in association with enhanced phospho-ERK levels. This switch results in E-cadherin loss, enhanced invasion, and constitutes an independent factor of poor prognosis in melanoma patients.

Whereas immunotherapies have revolutionized the treatment of different solid and hematological cancers, their efficacy in nodal peripheral T-cell lymphomas (PTCLs) is limited, due to a lack of understanding of the immune response they trigger. To fully characterize the immune tumor microenvironment (TME) of PTCLs, we performed spectral flow cytometry analyses on 11 angioimmunoblastic T-cell lymphomas (AITL), 7 PTCL, not otherwise specified (PTCL, NOS) lymph node samples, and 10 non-tumoral control samples. The PTCL TME contained a larger proportion of regulatory T cells and exhausted CD8+ T cells, with enriched expression of druggable immune checkpoints. Interestingly, CD39 expression was up-regulated at the surface of most immune cells, and a multi-immunofluorescence analyses on a retrospective cohort of 43 AITL patients demonstrated a significant association between high CD39 expression by T cells and poor patient prognosis. Together, our study unravels the complex TME of nodal PTCLs, identifies targetable immune checkpoints, and highlights CD39 as a novel prognostic factor.

Abstract Background Dendritic cells (DCs) are promising targets for cancer immunotherapies owing to their central role in the initiation and the control of immune responses. Their functions encompass a wide range of mechanisms mediated by different DC subsets. Several studies have identified human tumor- associated DC (TA-DC) populations through limited marker-based technologies, such as immunostaining or flow cytometry. However, tumor infiltration, spatial organization and specific functions in response to immunotherapy of each DC subset remain to be defined. Methods Here, we implemented a multiplexed immunofluorescence analysis pipeline coupled with bio-informatic analyses to decipher the tumor DC landscape and its spatial organization within melanoma patients’ lesions, and its association with patients’ response to immune checkpoint inhibitors (ICI). For this aim, we analyze a cohort of 41 advanced melanoma patients treated with anti- PD1 alone or associated with anti-CTLA4. Distance and cell network analyses were performed to gain further insight into the spatial organization of tumor-associated DCs. A Digital Spatial Profiling analysis further characterized ecosystem of tumor-infiltrating DCs. Results Plasmacytoid DCs (pDCs) were the most abundant DC population, followed by conventional cDC1 and mature DCs, present in equal proportions. In contrast to CD8 + T cell frequency, and despite varying densities, all DC subsets were associated with a favorable response to ICI. Distance and cell network analyses demonstrated that tumor-infiltrating DCs were largely organized in dense areas with high homotypic connections, except for cDC1 that exhibited a more scattered distribution. We identified four patterns of ecosystems with distinct preferential interactions between DC subsets. Significantly, the proximity and interactions between CD8 + T cells and cDC1 were positively associated with patients’ response to ICI. Conclusions Our study unravels the complex spatial organization of DC subsets and their interactions in melanoma patient lesions, shedding light on their pivotal role in shaping the response to ICI. Our discoveries regarding the spatial arrangement of cDC1, especially with CD8+ T cells, provide valuable clues for improving immunotherapeutic strategies in melanoma patients. What is already known on this topic Dendritic cells (DCs) are promising targets for cancer immunotherapies owing to their central role in the initiation and the control of immune responses. Although conventional type 1 dendritic cells (cDC1) were proposed to contribute to immunotherapy response, their precise functions and interactions with other immune populations in human cancers are largely unknown. What this study adds This study provides a precise characterization of the spatial distribution and organization of tumor- infiltrating DCs in a large cohort of advanced melanoma patients, and in correlation with response to immunotherapy. While DCs are organized in dense areas with high homotypic connections, cDC1 exhibit a more scattered distribution and form heterotypic aggregates with other DC subsets. More importantly, a close connection between cDC1 and CD8 T cell is uniquely correlated with the patients’ response to immunotherapy. How this study might affect research, practice or policy This study improves our understanding of CD8-DC spatial organization within the tumor microenvironment and will have a broad spectrum of implications in the design of anti-tumor immune-activating compounds and the design of biomarkers of response to immunotherapy for melanoma patients.

Abstract Cell plasticity sustains intra-tumor heterogeneity and treatment resistance in melanoma. Deciphering the transcriptional mechanisms governing reversible phenotypic transitions between proliferative/differentiated and invasive/stem-like states is required in order to design novel therapeutic strategies. EMT-inducing transcription factors, extensively known for their role in metastasis in carcinoma, display cell-type specific functions in melanoma, with a decreased ZEB2/ZEB1 expression ratio fostering adaptive resistance to targeted therapies. While ZEB1 direct target genes have been well characterized in carcinoma models, they remain unknown in melanoma. Here, we performed a genome-wide characterization of ZEB1 transcriptional targets, by combining ChIP-sequencing and RNA-sequencing, upon phenotype switching in melanoma models. We identified and validated ZEB1 binding peaks in the promoter of key lineage-specific genes related to melanoma cell identity. Comparative analyses with breast carcinoma cells demonstrated melanoma-specific ZEB1 binding, further supporting lineage specificity. Gain- or loss-of-function of ZEB1, combined with functional analyses, further demonstrated that ZEB1 negatively regulates proliferative/melanocytic programs and positively regulates both invasive and stem-like programs. We then developed single-cell spatial multiplexed analyses to characterize melanoma cell states with respect to ZEB1/ZEB2 expression in human melanoma samples. We characterized the intra-tumoral heterogeneity of ZEB1 and ZEB2 and further validated ZEB1 increased expression in invasive cells, but also in stem-like cells, highlighting its relevance in vivo in both populations. Overall, our results define ZEB1 as a major transcriptional regulator of cell states transitions and provide a better understanding of lineage-specific transcriptional programs sustaining intra-tumor heterogeneity in melanoma. statement of significance We identify a ZEB1-driven, lineage-specific transcriptional program governing cell states transitions in melanoma, driving the emergence of invasive and stem-like states, and demonstrate its relevance in sustaining intra-tumor heterogeneity in human samples.

Abstract Metastatic melanoma patients carrying a BRAF V600 mutation can be treated with BRAF inhibitors (BRAFi), in combination with MEK inhibitors (MEKi), but innate and acquired resistance invariably occurs. Resistance can involve transcriptional- and epigenetic-based phenotypic adaptations, as yet unpredictable. Predicting patient response to targeted therapies is crucial to guide clinical decision. We describe here the development of a highly efficient patient-derived xenograft model adapted to patient melanoma biopsies, using the avian embryo as a host (AVI-PDX ™ ). In this in vivo paradigm, we depict a fast and reproducible tumor engraftment of patient samples within the embryonic skin, preserving key molecular and phenotypic features. We show that sensitivity and resistance to BRAFi/MEKi targeted therapies can be reliably modeled in these AVI-PDX ™ , as well as synergies with other drugs, such as HDACi. We further provide proof-of-concept that the AVI-PDX ™ models the diversity of responses of melanoma patients to BRAFi/MEKi, within days, hence positioning it as a valuable tool for the design of personalized medicine assays and for the evaluation of novel combination strategies.

The need for reliable biomarkers to predict clinical benefit from anti-PD1 treatment in metastatic melanoma (MM) patients remains unmet. Several parameters have been considered in the tumor environment or the blood, but none has yet achieved sufficient accuracy for routine clinical practice. Whole blood samples from MM patients receiving second-line anti-PD1 treatment (NCT02626065), collected longitudinally, were analyzed by flow cytometry to assess the immune cell subsets absolute numbers, the expression of immune checkpoints or ligands on T cells and the functionality of innate immune cells and T cells. Clinical response was assessed according to Progression-Free Survival (PFS) status at one-year following initiation of anti-PD1 (responders: PFS > 1 year; non-responders: PFS ≤ 1 year). At baseline, several phenotypic and functional alterations in blood immune cells were observed in MM patients compared to healthy donors, but only the proportion of polyfunctional memory CD4+ T cells was associated with response to anti-PD1. Under treatment, a decreased frequency of HVEM on CD4+ and CD8+ T cells after 3 months of treatment identified responding patients, whereas its receptor BTLA was not modulated. Both reduced proportion of CD69-expressing CD4+ and CD8+ T cells and increased number of polyfunctional blood memory T cells after 3 months of treatment were associated with response to anti-PD1. Of upmost importance, the combination of changes of all these markers accurately discriminated between responding and non-responding patients. These results suggest that drugs targeting HVEM/BTLA pathway may be of interest to improve anti-PD1 efficacy.