Abstract Durotaxis – the ability of cells to sense and migrate along stiffness gradients – is important for embryonic development and has been implicated in pathologies including fibrosis and cancer. Although cellular processes can sometimes turn toward softer environments, durotaxis at the level of cells has thus far been observed exclusively as migration from soft to stiff regions. The molecular basis of durotaxis, especially the factors that contribute to different durotactic behaviors in various cell types, are still inadequately understood. With the recent discovery of ‘optimal stiffness’, where cells generate maximal traction forces on substrates in an intermediate stiffness range, we hypothesized that some migratory cells may be capable of moving away from stiff environments and toward matrix on which they can generate more traction. Combining hydrogel-based stiffness gradients, live-cell imaging, genetic manipulations, and computational modeling, we found that cells move preferentially toward their stiffness optimum for maximal force transmission. Importantly, we directly observed biased migration toward softer environments, i.e. ‘negative durotaxis’, in human glioblastoma cells. This directional migration did not coincide with changes in FAK, ERK or YAP signaling, or with altered actomyosin contractility. Instead, integrin-mediated adhesion and motor-clutch dynamics alone are sufficient to generate asymmetric traction to drive both positive and negative durotaxis. We verified this mechanistically by applying a motor-clutch-based model to explain negative durotaxis in the glioblastoma cells and in neurites, and experimentally by switching breast cancer cells from positive to negative durotaxis via talin downregulation. Our results identify the likely molecular mechanisms of durotaxis, with a cell’s contractile and adhesive machinery dictating its capacity to exert traction on mechanically distinct substrates, directing cell migration.

Abstract Filopodia assemble unique integrin-adhesion complexes to sense the extracellular matrix. However, the mechanisms of integrin localization and regulation in filopodia are poorly defined. Here, we observed that active integrins accumulate at the tip of myosin-X(MYO10)-positive filopodia while inactive integrins are uniformly distributed. RNAi depletion of 10 integrin activity modulators identified talin as the principal integrin activator in filopodia. Deletion of the MYO10-FERM domain, or mutation of the β1-integrin-binding residues within, revealed MYO10 as facilitating integrin activation but not transport in filopodia. However, MYO10-FERM alone could not activate integrins, potentially due to dual binding to both a- and β-integrin tails. As swapping MYO10-FERM with talin-FERM enabled integrin activation in filopodia, our data indicate that an integrin-binding FERM domain coupled to a myosin motor is a core requirement for integrin activation in filopodia. Therefore, we propose a two-step integrin activation model in filopodia: receptor tethering by MYO10 followed by talin-mediated integrin activation.

Spatially controlled, cargo-specific endocytosis is essential for development, tissue homeostasis, and cancer invasion and is often hijacked by viral infections 1 . Unlike clathrin-mediated endocytosis, which exploits cargo-specific adaptors for selective protein internalization, the clathrin and dynamin-independent endocytic pathway (CLIC-GEEC, CG-pathway) has until now been considered a bulk internalization route for the fluid phase, glycosylated membrane proteins and lipids 2,3 . Although the core molecular players of CG endocytosis have been recently defined, no cargo-specific adaptors are known and evidence of selective protein uptake into the pathway is lacking 3 . Here, we identify the first cargo-specific adaptor for CG-endocytosis and demonstrate its clinical relevance in breast cancer progression. By combining unbiased molecular characterization and super-resolution imaging, we identified the actin-binding protein swiprosin-1 (EFHD2) as a cargo-specific adaptor regulating integrin internalization via the CG-pathway. Swiprosin-1 couples active Rab21-associated integrins with key components of the CG-endocytic machinery, IRSp53 and actin. Swiprosin-1 is critical for integrin endocytosis, but not for other CG-cargo and supports integrin-dependent cancer cell migration and invasion, with clinically relevant implications for breast cancer. Our results demonstrate a previously unknown cargo selectivity for the CG-pathway and opens the possibility to discover more adaptors regulating it.

Myosin-X (MYO10), a molecular motor localizing to filopodia, is thought to transport various cargo to filopodia tips, modulating filopodia function. Yet, only a few MYO10 cargoes have been described. Here, using GFP-Trap and BioID approaches combined with mass spectrometry, we identified lamellipodin (RAPH1) as a novel MYO10 cargo. We report that the FERM domain of MYO10 is required for RAPH1 localization and accumulation at filopodia tips. Previous studies have mapped RAPH1 interaction with adhesome components to its talinbinding and Ras-association domains. Surprisingly, we find that the RAPH1 MYO10-binding site is not within these domains. Instead, it comprises an area with previously unknown functions. Functionally, RAPH1 supports MYO10 filopodia formation and stability but is not involved in regulating integrin activity in filopodia tips. Taken together, our data indicate a feed-forward mechanism whereby MYO10 filopodia are positively regulated by MYO10-mediated transport of RAPH1 to the filopodium tip.

Abstract In breast cancer, the currently approved anti-receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 (HER2) therapies do not fully meet the expected clinical goals due to therapy resistance. Identifying alternative HER2-related therapeutic targets could offer means to overcome these resistance mechanisms. We have previously demonstrated that an endosomal sorting protein, sortilin-related receptor (SorLA), regulates the traffic and signaling of HER2 and HER3, thus promoting resistance to HER2-targeted therapy in breast cancer. This study aims to assess the feasibility of targeting SorLA using a monoclonal antibody. Our results demonstrate that anti-SorLA antibody (SorLA ab) alters the resistance of breast cancer cells to HER2 monoclonal antibody trastuzumab in vitro and in ovo . We found that SorLA ab and trastuzumab combination therapy also inhibits tumor cell proliferation and tumor cellularity in a mouse xenograft model of HER2-positive breast cancer. In addition, SorLA ab inhibits the proliferation of breast cancer patient-derived explant three-dimensional cultures. These results provide for the first time proof-of-principle that SorLA is a druggable target in breast cancer.

Current evidence indicates that resistance to HER2-targeted therapies is frequently associated with HER3 and active signaling via HER2-HER3 dimers, particularly in the context of breast cancer. Thus, understanding the response to HER2-HER3 signaling and the regulation of the dimer per se remains essential to decipher therapy relapse mechanisms. Here, we demonstrate that signaling by HER3 growth factor ligands, heregulins, support the transcription of a type-1 transmembrane sorting receptor, sortilin-related receptor (SorLA; SORL1 ) downstream of the mitogen-activated protein kinase pathway. In addition, we demonstrate that SorLA interacts directly with HER3, forming a trimeric complex with HER2 and HER3 to attenuate lysosomal degradation of the dimer through a Rab4-dependent manner. In line with a role for SorLA in supporting the stability of the HER2 and HER3 receptors, loss of SorLA compromised heregulin-induced cell proliferation and sensitized metastatic anti-HER2 therapy-resistant breast cancer cells to neratinib in cancer spheroids in vitro and in vivo in a zebrafish brain xenograft model. Collectively, our results demonstrate a novel feed-forward loop consisting of heregulin, HER2-HER3 and SorLA, which controls breast cancer growth and anti-HER2 therapy resistance in vitro and in vivo . Significance HER3 signaling, through ERK/MAPK, upregulates SorLA and SorLA controls the trafficking and stability of HER3 to support cancer proliferation and neratinib resistance.

We previously identified talin rod domain-containing protein 1 (TLNRD1) as a potent actin-bundling protein in vitro. Here, we report that TLNRD1 is expressed in the vasculature in vivo. Its depletion leads to vascular abnormalities in vivo and modulation of endothelial cell monolayer integrity in vitro. We demonstrate that TLNRD1 is a component of the cerebral cavernous malformations (CCM) complex through its direct interaction with CCM2, which is mediated by a hydrophobic C-terminal helix in CCM2 that attaches to a hydrophobic groove on the four-helix domain of TLNRD1. Disruption of this binding interface leads to CCM2 and TLNRD1 accumulation in the nucleus and actin fibers. Our findings indicate that CCM2 controls TLNRD1 localization to the cytoplasm and inhibits its actin-bundling activity and that the CCM2-TLNRD1 interaction impacts endothelial actin stress fiber and focal adhesion formation. Based on these results, we propose a new pathway by which the CCM complex modulates the actin cytoskeleton and vascular integrity.

The cell nucleus is continuously exposed to external signals, of both chemical and mechanical nature. To ensure proper cellular response, cells need to regulate not only the transmission of these signals, but also their timing and duration. Such timescale regulation is well described for fluctuating chemical signals, but if and how it applies to mechanical signals reaching the nucleus is still unknown. Here we demonstrate that the formation of fibrillar adhesions locks the nucleus in a mechanically deformed conformation, setting the mechanical response timescale to that of fibrillar adhesion remodelling (~1 hour). This process encompasses both mechanical deformation and associated mechanotransduction (such as via YAP), in response to both increased and decreased mechanical stimulation. The underlying mechanism is the anchoring of the vimentin cytoskeleton to fibrillar adhesions and the extracellular matrix through plectin 1f, which maintains nuclear deformation. Our results reveal a mechanism to regulate the timescale of mechanical adaptation, effectively setting a low pass filter to mechanotransduction.

Human pluripotent stem cells (hPSC) can generate almost all adult cell lineages. While it is clear that key transcriptional programmes are important elements for maintaining pluripotency, the equally essential requirement for cell adhesion to specific extracellular matrix components remains poorly defined. Our recent observation that hPSC colonies form unusually large cornerstone focal adhesions (FA), distinct from parental somatic cells, that are lost following differentiation, emphasises the potential of these atypical FA as gatekeepers of pluripotency. Here, using nanopatterns, we further demonstrate that physical restriction of adhesion size, in hPSC colonies, is sufficient to trigger differentiation. Using superresolution two-colour interferometric photo-activated localization microscopy (iPALM), we examined the three-dimensional architecture of these cornerstone adhesions and report vertical lamination of FA proteins with three main structural peculiarities: 1) integrin β5 and talin are present at high density, at the edges of cornerstone FA, adjacent to a vertical kank-rich protein wall. 2) Vinculin localises higher than expected with respect to the substrata, and 3) surprisingly, actin and α-actinin are present in two discrete layers, a previously undescribed localisation for these proteins. Finally, we report that depletion of kanks diminishes FA patterning, and actin organisation within the colony, indicating a key role for kanks in hPSC colony architecture.

SUMMARY Focal adhesions (FAs) connect inner workings of the cell to the extracellular matrix to control cell adhesion, migration, and mechanosensing 1,2 . Previous studies demonstrated that FAs contain three vertical layers, which connect extracellular matrix to the cytoskeleton 3,4,5 . However, cellular processes rely on precisely-regulated FA turnover, but the molecular machineries that control FA assembly and disassembly have remained elusive. By using super-resolution iPALM microscopy, we identified two unprecedented nanoscale layers within FAs, specified by actin filaments bound to tropomyosin isoforms Tpm1.6 and Tpm3.2. The Tpm1.6-actin filaments beneath the previously identified ‘actin-regulatory layer’ are critical for adhesion maturation and controlled cell motility, whereas the Tpm3.2-actin filament layer towards the bottom of FA facilitates adhesion disassembly. Mechanistically, Tpm3.2 stabilizes KANK-family proteins at adhesions, and hence targets microtubule plus-ends to FAs to catalyse their disassembly. Loss of Tpm3.2 leads to disorganized microtubule network, abnormally stable FAs, and defects in tail retraction during cell migration. Thus, FAs are composed of at least three distinct actin filament layers, each having specific roles in coupling of adhesion to the cytoskeleton, or in controlling adhesion dynamics. In a broader context, these findings demonstrate how distinct actin filament populations can co-exist and perform specific functions within a defined cellular compartment.